植物纤维：超微结构分析

利用电子显微镜可以观察到光学显微镜无法观察到的超微结构，如纤维细胞壁的分层结构，各层微纤维的形态及与纤维轴的夹角，纹孔的微细结构，其他细胞如导管、木射线、薄壁细胞等的微细结构，纤维表面的微细结构，纸页表面的微观形态等。

利用扫描电镜分析样品的制样过程相对比较简单。例如，要观察纸张或浆料内纤维的微细结构，只需将风干试样固定在样品台上，利用真空的镀膜法在要观察的样品表面覆盖一层金属（通常采用镀金，主要为了增加标准样品形貌的二次电子量，使有用信号加强）后，即可在扫描电镜上观察和拍照。

透射电镜具有更高的分辨率，但制样过程比较复杂。当观察和分析纤维样品的微细结构时，样品必须能让电镜电子枪发射的电子束穿透，即要制备出厚度非常薄的对电子束透明的样品。电子束穿透固体样品的能力主要取决于加速电压和样品物质的原子序数，对于透射电镜常用的50～100kV电子束来说，观察用片的厚度一般为50～70nm，最大不超过200nm。要制备如此薄的样品一般是采用超薄切片法和复型法。

（一）超薄切片

超薄切片法用于研究原料、纤维素等试样切面的微细结构，利用超薄切片机可将试样厚度控制在50nm左右的范围。超薄切片法的制片过程包括固定、染色、脱水、包埋、切片等程序。固定使样品在随后的处理过程中不产生变形，染色可提高样品的反差，包埋是为了使切片极薄，完整且均匀。

1.试剂与仪器

a.甘油-酒精混合液（甘油∶酒精=1∶1，体积比）；b.30%，50%，70%，90%，95%，100%乙醇溶液；c.高锰酸钾溶液（20g/L）；d.包埋剂（由20%甲基丙烯酸甲酯和80%甲基丙烯酸丁酯配制而成）；e.引发剂：过氧化苯甲酰；f.超薄切片机。

2.制片方法

（1）木材原料

① 试样的制备：切取1cm×1cm×2cm的新鲜木块若干置于烧杯中，用水煮沸数分钟后浸入冷水中，再煮沸再浸入冷水中，如此反复数次以排除木片中的空气。然后用1∶1（体积比）的甘油-酒精混合液在127℃下软化10h。把软化了的木块充分水洗，削去最外面的一层纤维后，切取1mm×1mm×2mm大小的试样若干。当切纵切面时，纵向长2mm，其余两个方向各1mm；切横切面时则横向为2mm。这样可以利用其几何形状来保证包埋和切片的方向。

② 固定和染色：将切取的试样用20g/L的高锰酸钾溶液浸泡4h，使之固定并染色后，再用水洗。

③ 脱水：用30%，50%，70%，90%，95%，100%乙醇逐级脱水。其中100%乙醇脱水两次，各级时间20min。

④ 包埋：脱水后试样先用包埋剂浸渍1h。将包埋剂和1.5%的引发剂混合，在80℃油浴温度下不断搅拌，使之均匀并预聚合到黏稠状就可用于包埋。在空心胶囊或特制锥形塑料囊中先放入一定包埋剂，然后用烘干的牙签，将已用包埋剂浸透的试样放入胶囊底部中央。加包埋剂至胶囊平口，切勿多加，以免受热后膨胀溢出。在置于60℃的烘箱中聚合24h制成包埋块。包埋块要保持在干燥器内，以防吸潮。

⑤ 超薄切片：聚合后已硬化的包埋块用超薄切片机切片后，可供电镜观察用。

（2）浆料

对于浆料的超薄切片，为了包埋方便，蒸煮后的木片不要揉散。反复用蒸馏水浸泡，置换出其中的蒸煮残液，使浆料仍保留着原来木片的外形。切取1mm×1mm×2mm大小的试样，再按上述方法进行固定、染色、脱水、包埋剂切片。

（3）草类原料

将试样切成约20mm长、3～5mm宽的小片，用甘油-酒精混合液在127℃软化处理1.5h。取出用水洗净后，选择适用的部位将试样切成约8mm长、1mm宽、厚度不超过1mm的小块，用20g/L的高锰酸钾溶液在室温下浸泡2h，使纤维染色并起固定作用。然后参考上述木材原料的制片方法进行逐级脱水、浸渍、包埋、硬化和切片。

（二）复型法

复型法用于研究原料、纸页、纤维等试样表面的微细结构。将试样表面纤维组织的浮雕特征复制到一层薄膜上，然后将复制的膜，放到透射电镜中去观察分析。对用于制备复型的材料有如下要求：

① 本身必须是非晶体的，以达到在高倍成像时不显示其本身的任何结构细节，不致干扰被复制表面形貌的观察和分析；(www.xing528.com)

② 尽量选择分子尺寸小的物质，以提高分辨率；

③ 必须有足够的强度和刚度，使之在制备过程中不致破损或畸变；

④ 在电子束轰击下不易烧蚀，分解。常用的复型材料有塑料、光谱纯碳等。复型分为正复型和负复型两种。正复型的表面浮雕凹凸特征与样品表面相同，而负复型的表面浮雕凹凸特征与样品表面则正好相反。正复型比较方便于图像的辨认与分析，而负复型的制备过程比较简单。

1.试样的制备

（1）木材

根据研究的需要选取材种、树龄及部位等，取新鲜未干燥过的原木先锯成木饼，然后沿径向劈成1cm×1cm×1.5cm的小块，材质较硬的材种可先进行软化处理。研究纤维细胞壁各层微纤维形态和纹孔等微细结构时，用单面刀片顺径向切开一道口，然后撕成厚度为1mm左右的薄片。选取撕裂面比较平整者供下一步处理用。研究细胞腔的微细结构时，用纤维切片机切出沿径向面的薄片。为了使纤维细胞壁各层微纤维更好的暴露出来，可用等体积的冰醋酸和30%浓度的双氧水在60℃下处理薄片样品18～20h。对于树脂含量高的木材，可用二甲苯溶去树脂，以便于纤维细胞腔的观察。

（2）草类原料、浆料与纸

竹子、芦苇等原料可参考木材试样的制备方法。甘蔗渣纤维可在解离后抄成小片，浆料抄成浆片，对纸张样品应先确定纸页两面中用于复型的面，将试样剪切成1cm×1cm大小。

2.复型

正复型的方法可得到与被分析样品表面形貌凹凸特征一致的复型，方便于图像的辨认与分析。正复型的制备步骤包括：形成中间复型（负复型）、剥离、金属投影、形成正复型、溶去中间复型等。

用作中间复型的材料应该考虑其溶解性和强度，一般采用醋酸纤维、甲基苯烯酸酯等塑料物质。形成中间复型最简单的方法是，在样品要复型的洁净表面直接放上少量的塑料液，待其溶剂挥发后即形成复型膜。也可以将事先制备好的塑料膜，贴在要复型样品的洁净表面上，施以一定的压力和温度，从而制得复型膜。复型膜与样品的分离可采用剥离法，也可用适当的溶剂溶去样品，而留下复型膜。

塑料膜可购买复型制样专用的薄膜（如醋酸纤维素薄膜）。也可自制。自制薄膜的方法有多种，例如可以将配制好的塑料溶液（如醋酸纤维素的丙酮溶液；甲基丙烯酸甲酯、乙酯的苯溶液；聚苯乙烯的苯溶液；火棉胶的乙酸正戊酯溶液等）置于标本缸中。将一块洁净干燥的载玻片浸入溶液中，静置数秒钟，提起后垂直地挂在标本缸内溶液的上方干燥半小时，然后移到洁净处直立晾干，在载玻片上便形成一层薄膜。也可以将塑料液倒在干净平滑的玻璃片上，倾斜转动玻璃片，使液体大面积展平，溶剂挥发、干燥后即成薄膜。厚度合适的薄膜应该既能在复型膜剥离时不破损和变形，又能在后面的步骤中容易溶解。

（三）复兴法示例

1.试剂与仪器

甲基丙烯酸乙酯薄膜；苯；载玻片；夹子；刀片；镊子，铜网布制小勺；样品铜网。

2.复型步骤

将甲基丙烯酸乙酯薄膜放在载玻片上，将样品的复型面正对薄膜放好，再盖上一片载玻片，用夹子将玻片的两端夹牢，于80℃烘箱中加热15min后，取出自然冷却至室温。剥去或用胶纸粘去薄膜上的试样，即得到中间复型（剥离过程中应注意使复型表面干净且不变形）。

将剥离的中间复型膜置于真空镀膜机中，浮雕面向上，先以倾斜方向作铬投影，以提高复型图像的衬度，再从垂直方向喷碳，碳膜的厚度可用放在中间复型膜旁边的乳白色瓷片表面颜色的变化来估计，一般认为变成浅棕色为宜。喷碳后得到两级复型叠在一起的“复合复型”。

用锋利的刀片把“复合复型”切成略小于样品铜网的小方块，置于苯中，溶去中间复型膜后留下碳膜，即得到正复型。用铜网布制成的小勺将碳膜转移到清洁的苯中洗涤，然后转移到蒸馏水中，依靠水的表面张力使碳膜平展并漂浮在水面上，再用镊子夹住样品铜网把复型捞起，干燥后即可放进透射电镜中观察。