淀粉及其衍生物的氮含量检测

（一）测定原理

淀粉及其衍生物的氮含量包括样品中的游离氨基酸、水解产生氨基酸的化合物和胺类化合物的氮含量，但不包括硝酸盐和硝酸根中所含的氮。淀粉含氮量高有许多不利影响，如使用时会产生臭味或其他气味；蒸煮易产生泡沫；水解时易变色等。

这些氮元素在样品中多以有机化合物的形式存在，不能直接测试。需要在催化剂和高温作用下，用浓硫酸消化淀粉及其衍生物中含氮的物质，使蛋白质分解，变成无机氮而生成氨，分解的氨与硫酸结合全部转换成硫酸铵；然后用氢氧化钠碱化反应物变成氨，并进行蒸馏使硫酸铵中的铵（NH⁴⁺）以氨气的形式释放出来；同时用加有指示剂的硼酸溶液吸收这些氨气后，用已标定的硫酸标准溶液滴定；根据酸碱中和反应来计算氮含量，如需测定蛋白质含量，可以用酸的消耗量乘以换算系数。

图7-7 凯氏定氮装置或消化蒸馏装置图

1—电炉 2—水蒸气发生器 3—螺旋夹 a 4—小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处）5—反应室 6—反应室外层 7—橡皮管及螺旋夹b 8—冷凝管 9—蒸馏液接收瓶

根据凯氏定氮测得的氮含量和氮在蛋白质中的含量为1/6.25（即16%），可计算得出样品中的蛋白质含量：蛋白质含量=含氮量×6.25。本滴定测试法（Titrimetric method，IDT）创始人是丹麦化学家Johan Kjeldahl（1849—1900）。因此称为凯氏定氮法，该仪器被称为凯氏定氮仪，又名定氮仪、蛋白质测定仪、粗蛋白测定仪。根据蛋白质中氮的含量恒定的原理，通过测定样品中氮的含量，可以计算出蛋白质含量。凯氏定氮蒸馏装置种类甚多，通常都由蒸气发生器、氨的蒸馏和氨的吸收三部分装置组成（见图7-7）。测定全过程包括：消化、碱化、吸收、滴定等步骤。

① 凯氏定氮法消化反应式为（其中CuSO₄做催化剂）：

含氮有机物+H₂SO₄+2H⁺═══（NH₄）₂SO₄+CO₂+H₂O

② 在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH₃，收集于H₃BO₃溶液中，碱化、蒸馏和吸收反应式为：

（NH₄）₂SO₄+2NaOH →2NH₃↑+2H₂O+Na₂SO₄

2NH₃+4H₃BO₃═══（NH₄）₂B₄O₇+5H₂O

③ 用已知浓度的H₂SO₄（或HCl）标准溶液滴定，根据酸消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，可以得到蛋白质的含量。滴定反应式为：

（NH₄）₂B₄O₇+H₂SO₄+5H₂O═══（NH₄）₂SO₄+4H₃BO₃

（NH₄）₂B₄O₇+2HCl+5H₂O═══2NH₄Cl+4H₃BO₃

（二）仪器及试剂

凯氏烧瓶：单口圆底烧瓶，容量500～800mL，瓶颈处可放置一个小漏斗。

消化架：能使凯氏烧瓶以倾斜位置加热，并且仅使液面以下的瓶壁受热。

凯氏定氮蒸馏装置：包括蒸馏装置、凯氏烧瓶，有一个200mL的漏斗和防溅球管，后者可把凯氏烧瓶和冷凝管相连。

滴定管：0.05mL刻度的25mL或0.01mL刻度的10mL酸式滴定管。

研钵或机械磨；筛子：筛眼孔径为0.6mm；直形冷凝管；锥形瓶：500mL；量筒：100mL；分析天平，最小刻度为0.0001g。

浓硫酸：96%（m/m）、ρ₂₀=1.84g/mL（18.0mol/L）。

0.05mol/L硫酸标准滴定液：取浓硫酸3mL，缓缓注入适量水中，冷却至室温，加水稀释至1000mL，摇匀。或0.05mol/L的盐酸标准溶液。

氢氧化钠溶液：30%（质量分数）、ρ₂₀=1.33g/mL（溶液浓度可以大于1.33g/mL）；硼酸溶液：20g/L（或2%）；混合催化剂：由97g硫酸钾和3g无水硫酸铜组成。

指示剂：由两份中性甲基红冷饱和溶液与一份浓度为0.25g/L亚甲蓝溶液混合而成，贮存于棕色玻璃瓶内。二者均采用50%（体积分数）乙醇溶液配制。

（三）测定方法

1.样品预处理

充分快速地混匀样品，放在密封干燥的容器内。对块状样品必须研磨，使之全部过筛，不留下剩余样品。

2.取样及称量

根据样品含氮量称取至多10g样品（固体样品0.2～2.0g或半固体样品2～5g或液体样品吸取10～20mL，约相当氮30～40mg），精确至0.001g，然后倒入干燥的凯氏烧瓶内，注意不要将样品沾在瓶颈内壁上。对黏状或糊状样品，则可选择用不产生氮的小玻璃盛器或铝片、塑料片进行称量，也可使用氮含量已知的盛器称重，如盛器产生氮，应做空白测定后折算。

3.消化

加入硫酸铜催化剂10g，并用量筒加入适量的浓硫酸（加入量=20+4×样品质量，以mL计）。浓硫酸沿瓶颈内壁流下，轻轻摆动烧瓶，混合瓶内样品，直至团块消失，样品完全湿透后，加入防沸物（如玻璃珠）以防暴沸。此时烧瓶内物质炭化变黑，并产生大量泡沫，务必注意防止气泡冲出管口。把小漏斗放置于瓶颈处，烧瓶放到消化架上开始加热消化（如用电炉加热，需借助有小孔的石棉网；如用燃气加热，保证火苗不超过烧瓶内装有液体的部位，以防氮的损失）。小心加热液体，泡沫完全停止后，使之逐渐沸腾，保持瓶内液体微沸，待液体澄清以后继续加热1h。取相同量的硫酸铜、浓硫酸同一方法做试剂空白试验（可以同时进行）。(www.xing528.com)

在消化过程中要随时转动烧瓶，以使内壁黏着物质均能流入底部，以保证样品完全消化。整个消化过程均应在通风橱中进行。如果用气体加热消化设备，保证火苗不超过烧瓶内装有液体的部位，以防氮损失。此步骤可以在消解仪中进行，一次可以消解多个样品，并有通风橱进行通风，温度可以参考设定。

4.蒸馏和滴定

将烧瓶取下，待其内液体冷却，通过漏斗定量移入定氮蒸馏装置的蒸馏瓶（锥形瓶），并用水冲洗几次，小心地加入50～200mL水（根据蒸馏瓶大小决定），直至蒸馏瓶内溶液总体积约200mL。注意蒸馏器应预先蒸馏，将氨洗净。混合瓶内物质，将烧瓶接上蒸馏装置。

将硼酸溶液25～50mL和2～3滴指示剂加入到500mL锥形瓶中，调节定氮蒸馏装置的冷凝管下端出口管，使之恰好碰到500mL锥形烧瓶的底部；再通过漏斗加入150～200mL的氢氧化钠溶液，使消化液碱化。注意漏斗颈部不能被排空，保证有液封。

打开冷凝管的冷凝水，开始蒸馏。瓶中指示剂立刻显示碱性颜色。在此过程中，保证产生的蒸汽量恒定。蒸汽通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内。

用20～30min收集到锥形瓶内液体约有200mL时，即可停止蒸馏。停止加热，降下锥形瓶，使冷凝管口离开液面，让多余冷凝水再滴入瓶内，再用水漂洗冷凝管末端，水也滴入瓶内，保证释放氨定量进入锥形瓶，瓶内液体已呈绿色。

用10mL或25mL的滴定管和已标定的硫酸溶液滴定瓶内液体，直至颜色变为紫红色，读下耗用硫酸标准溶液的毫升数。

（四）结果计算

淀粉及其衍生物的氮含量是以样品氮质量对样品原质量的百分比表示，为：

式中 X——样品氮含量，mg/100g

c——用于滴定的标准硫酸溶液的浓度，mol/L

V₀——空白测定所用硫酸溶液的体积，mL

V₁——样品测定所用硫酸溶液的体积，mL

14.01——氮的毫摩尔质量，mg/mmol

m——样品的质量，g

100——计算结果换算为毫克每百克（mg/100g）的换算系数

（五）注意事项

① 实验需要做平行试验，对同一样品进行两次测定。然后再用试剂作空白测定，如样品盛器含氮，则应将盛器进行空白测定。而且所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。蒸馏连接用的乳胶管或橡胶管，应用氢氧化钠试液煮20min，洗去碱液后用水煮沸，洗净，晾干。

② 当平行实验测定所耗用的硫酸标准溶液体积差不超过0.1mL时，取平行试验结果的算术平均值作为试验结果，计算结果保留三位小数。

③ 一般消解温度都设在240℃及以上，如需快速消解，可以适当提高温度甚至可以用最大温度进行消解，常加入硫酸钾，使溶液沸点从290℃升高到400℃以上。消化时，若发现瓶壁上有黑点，可适当转动烧瓶，使硫酸回流时将黑点洗下，以保证消化完全。消化液应放冷后，再沿瓶壁缓缓加水，防止供试液局部过热爆沸，冲出瓶外。

④ 前者有汞化物（HgO、HgCl₂、HgSO₄）、汞、硫酸铜、硒粉和过氧化氢等。后者有硫酸铜与氧化汞的混合物、硫酸铜与硫酸钾的混合物、硫酸钾、硫酸汞与硒粉混合物等。一般认为汞化物及硒粉的催化效能大于铜化物，而混合催化剂的催化效能又大于单一催化剂。混合催化剂中硫酸钾的作用是提高反应溶液浓硫酸的沸点，使淀粉分解完全，而硫酸铜则促进淀粉样品的分解与氧化。但该比例测定阳离子淀粉的氮含量时，操作时间长达6h，测定误差一般在5%左右，重现性小。

⑤ 蒸馏过程中若无黑色CuO析出，说明加入碱量不足，应补足碱量或重做实验。

⑥ 配制30%氢氧化钠溶液时，宜边加振摇，避免未溶解部分沉积于容器底部而难于溶解。

⑦ 锥形瓶加入硼酸溶液和指示剂后应显酒红色；如显绿色，说明锥形瓶有碱性物质污染。

⑧ 凯氏定氮法中影响测定准确性的因素有以下几个方面：

A.样品消化的完全程度。如被浓硫酸脱水的样品（有机物），炭化成的氮，由于消化不完全就不能被二氧化硫完全还原成氨，就会造成测定结果偏低。

B.消化温度。消化时不能用强火，应保持缓和沸腾，以免黏附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下未消化完全而造成氮损失。

C.蒸馏装置的气密性。若气密性差（漏气），蒸馏出来的氨气就会挥发流失（所以，漏斗加碱后应立刻水封，以免氨气由此处逸出而造成损失）。

D.吸收液的温度及吸收滴定操作。硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则对氨的吸收作用减弱，而造成氨损失；约80%以上的氨在最初1～2min内蒸出，初蒸速度不宜太快，以免氨蒸出后未能及时被吸收而逸失。且蒸馏出的氨吸收液应尽快滴定，避免放置时间过长，影响测定结果。

⑨ 凯氏定氮法的缺陷：此法为国标所推荐的测定法，为大多数研究者及生产检验所采用。但程序烦琐、耗时长、试剂用量大，测定一个样品约需5～6h，其中消化时间长达4h。而且从凯氏定氮原理可以知道，凯氏定氮法是将含氮有机物转变为无机氮硫酸铵来进行检测，然后以得到含氮量的测定值乘以一定系数得出蛋白质含量。如果该法作为现行国家标准和国际通行测定方法用于食品如奶粉中蛋白质含量的检测，则会有一定的漏洞。因为含氮有机物不仅仅是蛋白质，还有三聚氰胺等。蛋白质中的含氮量不超过30%，三聚氰胺的最大特点是含氮量很高（66%），溶于水后无色无味，如果在一杯清水中加入三聚氰胺，然后用凯氏定氮法检测，结果显示是含有蛋白质的。由于“凯氏定氮法”只能测出含氮量，并不能鉴定违规化学物质的存在，则添加三聚氰胺的奶粉理论上可以测出较高的蛋白质含量。