评价受试物的免疫调节作用

必须进行一系列的试验来证明受试物特有的免疫调节功能。现以免疫乳粉为例，介绍其具体过程。

以免疫初乳作为原料，经脱脂、去酪蛋白，制得免疫乳清，然后经杀菌、浓缩、冷冻干燥制成免疫初乳粉，每克免疫初乳粉免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）含量为0.521 6 g。在普通脱脂乳粉中添加一定量的免疫乳粉，使每克乳粉中含IgG 0.1 g，用于动物试验，剂量分别为1.0 g/kg、2.0 g/kg及6.0 g/kg，用蒸馏水调成各浓度，灌喂小鼠。以普通脱脂乳粉作为对照。小鼠为BALB/c品系，体重18～22 g，每组10只。免疫学功能评价依据原卫生部《保健食品功能学评价程序和检验方法》进行，评定的项目包括血清溶血素试验、抗体生成试验、小鼠碳廓清试验、刀豆蛋白诱导的脾淋巴细胞转化试验、迟发型变态反应、NK细胞活性试验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验。

1.血清溶血素试验

小鼠连续给样4周后，用绵羊红细胞（SRBC）免疫，5 d后眼眶采血，分离血清，在96孔微量血凝板上加25 μL生理盐水，在第一排加入25 μL血清，以后各排做倍比稀释，每孔加1滴1%的SRBC，振荡后于37℃放置3 h，当对照红细胞出现沉落后，观察结果，并计算出血清溶血素含量。

2.抗体生成试验

小鼠连续给样4周，再用SRBC免疫5 d后，动物颈椎脱臼处死，取脾脏，制成脾细胞悬液，调细胞浓度至5×106个/毫升。将表层培养基（1 g琼脂糖加双蒸水100 mL）加热溶解后，放入45℃水浴保温，与2倍浓度的Hank’s液（pH 7.2～7.4）等量混合，分装于小试管中，每管0.5 mL，再向管内加入50 μL 10%的SRBC、20 μL脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒在已刷琼脂薄层的6 cm平皿上，放入二氧化碳培养箱中培育1.5 h，然后用SA缓冲液稀释10倍的补体加入平皿中，继续培育1.5 h后，计算溶血空斑数。

3.碳廓清试验

小鼠尾静脉注射1∶3稀释的印度墨汁，立即计时。注入墨汁2 min、10 min后，分别从眼静脉丛取血20 μL，加到2 mL 0.1%的Na2CO3溶液中，用分光光度计在600 nm波长处测光密度（OD）值，以Na2CO3溶液做空白对照。根据动物体重、肝重与脾重计算吞噬指数。

4.刀豆蛋白诱导的脾淋巴细胞转化试验(www.xing528.com)

小鼠连续给样4周后，颈椎脱臼处死，取脾脏，制成脾细胞悬液，调整细胞浓度至2×106个/毫升，将细胞悬液分别加入24孔培养板的2个孔中，每孔1 mL，一孔加50 μL的刀豆蛋白液（相当于5 mg/L），另一孔作为对照，置于5%二氧化碳、37℃培养箱中培养72 h。培养结束前4 h，每孔轻轻吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的PRMI-1640培养液和50 μL噻唑蓝（MTT，5 mg/mL），继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1 mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解后，以570 nm波长进行比色测定。

5.迟发型变态反应

小鼠连续给样4周后，腹部去毛3 cm×3 cm，将1%的2，4-二硝基氟苯（DNFB）溶液50 μL均匀涂抹致敏。5 d后，以1%的DNFB溶液10 μL均匀涂抹于小鼠右耳进行“攻击”。24 h后，颈椎脱臼处死小鼠，用打孔器取下直径8 mm的左右耳片，称量并计算肿胀度。

6.NK细胞活性测定

小鼠连续给样4周后，颈椎脱臼处死，取其脾脏制成脾细胞（效应细胞）悬液。取传代后24 h的YAC-1细胞（靶细胞）加PRMI-1640完全培养液，调整细胞浓度至1×105个/毫升。取靶细胞和效应细胞各100 μL（细胞数量比为50∶1），加入U形96孔培养板，靶细胞自然释放，加入靶细胞和培养液各100 μL，最大释放孔加靶细胞和1%的NP40裂解液各100 μL。上述各项均设3个重复孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养4 h。然后将96孔培养板以1 500 r/min离心5 min，每孔吸取上清液100 μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100 μL。反应3 min后，每孔加入1 mol/L的盐酸30 μL，用酶标仪在490 nm处测定OD值，并计算NK细胞活性。

7.腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验

小鼠连续给样4周后，腹腔注射20%鸡红细胞悬液1 mL，30 min后，颈椎脱臼处死，固定于鼠板上，剪开腹壁皮肤，注射生理盐水2 mL，转动鼠板1 min，吸出腹腔洗液1 mL，分别滴于2片玻片上，37℃温盒培养30 min，用生理盐水漂洗，晾干，以1∶1丙酮-甲醇溶液固定，4% Giemsa酸缓冲液染色3 min，再用蒸馏水漂洗，晾干，用油镜镜检，计算吞噬百分率和吞噬指数。

用24种抗原对泌乳母牛进行免疫，制备的免疫初乳粉中含有24种抗人体肠道病原微生物的抗体，以此制备的免疫乳粉（每克含IgG 0.10 g）喂小鼠，可显著增强小鼠的体液免疫功能、细胞免疫功能及巨噬细胞吞噬功能，这些结果表明免疫乳粉具有免疫调节作用。