动物试验：哺乳动物生存试验方法详解

1.生存试验（寿命试验）

一切抗衰老措施的根本目的在于尽可能地延长寿命。所以，动物的生存试验非常受重视，其结果与其他抗衰老试验相比更具有说服力。生存试验是通过观察、统计生物的平均寿命（Mean Life Span）与最高寿命（Maximum Life Span）和生成的生存曲线来研究生物衰老规律与抗衰老措施的效果。

对于人类，因为遗传及环境因素对寿命的影响机制是十分复杂的，所以分别比较各种因素是困难的。在动物试验中，大多采用寿命较短的动物的遗传近交系，把环境因素固定下来，只是改变单一影响因素，这样探讨各种因素对寿命的影响较为方便。以哺乳动物作为对象的生存试验常用大鼠、小鼠与豚鼠等。但由于哺乳动物寿命较长（一般为2～3年），所以，还可选用寿命更短的家蝇、果蝇、轮虫、家蚕、四膜虫、鹌鹑等。除动物外，真菌和体外培养的细胞也可用于寿命实验。由于衰老过程是个普遍现象，使用生命周期短暂的生物，既可获得纯的品系，又可缩短试验周期，很多结果和哺乳动物模型具有一致性，因此有较大的参考价值。

（1）果蝇生存试验。选取未交配的、大小相近的果蝇，雌雄分养于一定温度和湿度的暗温箱中，不同组给予不同剂量的受试样品，以基础饲料作为对照，每天定时3次统计果蝇存活数、死亡数，直至果蝇全部死亡。对各组的平均体重、半数死亡时间、最高寿命、平均寿命等指标进行统计分析。如果任一剂量组、任一性别的平均寿命和/或最高寿命显著长于对照组，而未出现任何剂量组或性别显著低于对照组的结果，即可判定受试样品对果蝇有延缓衰老功能。同时，与果蝇生存试验的同一受试样品，还必须取得对哺乳动物（小鼠或大鼠）抗氧化功能的阳性结果，方可判定其对人有延缓衰老的功能。

（2）哺乳动物生存试验。哺乳动物生存试验的结果相比于果蝇生存试验的结果，可信度会高一些，但试验期较长，对试验条件的要求也较严格。

选择试验动物时，理论上当然任何哺乳动物均可，但从实际可行性上考虑，以大鼠或小鼠更适用。尤其是为缩短试验期，较多使用中年（12月龄）以上的大鼠或小鼠。随机分组，每组雌雄各半。

一般将动物分3个剂量组（高、中、低）及1个对照组。以灌胃、饮食或饮水的方式给各组相应剂量的受试样品，对照组食用基础饲料或正常饮水。在严格的喂饲条件下饲养，直至自然死亡，观察记录摄食与生活状态、各组动物饲料摄取量、生存日期。如果动物摄食与生活状态未见异常，尤其是剂量组与对照组摄食量无明显差异时，即可判定结果：按性别统计比较剂量组与对照组的平均寿命、最高寿命或半数死亡时间，如果剂量组的平均寿命显著比对照组长，即可判定该受试样品有延缓衰老的功能。

2.哺乳动物的抗氧化试验

过氧化脂质是根据衰老的自由基学说而建立的评价指标，包括测定MDA和脂褐素的含量。脂褐素是随年龄而逐渐增加集聚的一种有害物质，可以沉积在衰老动物的心、脑、肾上腺、骨骼肌等组织、器官中。MDA是极活泼的交联剂，能迅速和磷脂酰乙醇胺交联成荧光色素，然后和肽类、蛋白质或脂类结合成脂褐素。脂褐素使RNA不断减少，损坏细胞膜结构，最后导致细胞无法维持正常代谢而死亡。所以，目前脂褐素已经被公认为生物衰老的主要特征之一。另外，中间产物MDA也是常用的一个评价指标。

试验动物应选用品系明确、生长发育良好、性别单一的老龄鼠，随机分为高、中、低剂量组及对照组，分别给予受试样品。除老龄对照组外，另设一少龄对照组（大鼠3月龄，小鼠2月龄），老龄对照组与少龄对照组均不给受试样品。各组动物均饲养30 d以上。试验结束后检测过氧化脂质含量、抗氧化酶活性和MAO活性。

（1）过氧化脂质含量的测定。

全血、血清、组织匀浆中MDA的测定。利用磷钨酸，在稀硫酸条件下沉淀细胞和血清中的脂质过氧化物，然后在醋酸酸性条件下与硫代巴比妥酸反应，生成红色色素。该色素是荧光性物质，能被正丁醇提取，其荧光激发峰波长为532 nm，发射峰波长为553 nm，由于2个峰波接近，实际测定采用激发波长515 nm、发射波长553 nm。以四甲氧基丙烷为对照。本试验可间接地反映出受试物的抗氧化能力。

组织中过氧化脂质和脂褐素的测定。过氧化脂质与脂褐素是根据衰老的自由基学说建立的衰老生物学指标。因为过氧化脂质与脂褐素在细胞内的含量均与年龄呈正相关，并且在细胞内稳定存在，容易被测定，因此它们可以作为反映体内自由基含量的生物性指标。

测定血清中的过氧化脂质采用荧光法。原理是用过氧化脂质的分解产物——MDA与硫代巴比妥酸作用形成红色物质，利用荧光光度计测定此红色物质，从而求出MDA的含量。

脂褐素的测定原理是用MDA与氨基酸、核酸、蛋白质的氨基反应，生成具有荧光的化合物。这类化合物的荧光光谱与从不同动物组织中提取的脂褐素一致。脂褐素的化学本质是膜脂质与蛋白质过氧化后的一种复合产物，即席夫（Schiff）碱。测定席夫碱的含量，即可知道细胞被自由基损伤的程度，即过氧化程度，甚至可推断细胞衰老的程度。

哺乳动物的抗氧化试验虽然比较准确，但试验要求的条件高，操作烦琐。因此，研究中陆续开发了一些反映某种活性物质抗氧化能力的新的方法和指标。例如，某些化学反应能产生某一种特定的自由基，可通过一些指标测定加入的活性物质清除该自由基的能力。可利用黄嘌呤（Xan）-黄嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase，XOD）体系产生·，然后加入被测物，检测发光值的变化；也可利用Fenton体系产生·OH等。这些方法在试验中均广为应用。

（2）抗氧化酶活性的测定。根据衰老的自由基学说，存在于机体中的抗氧化酶能清除多余的自由基，保护机体免受自由基的攻击，体现出抗衰老的功能。随着年龄的增大，抗氧化酶的活性渐渐降低。

常用的抗氧化酶包括SOD、GSH-Px与CAT。(www.xing528.com)

SOD是机体清除氧自由基的重要酶，可以发生催化氧自由基的歧化反应。某些因素如衰老、心肌缺血、炎症等使自由基增加，并且组织中的SOD活性降低，引起氧自由基堆积，使膜脂质过氧化而导致组织损伤。所以测定组织或者红细胞中SOD活性可作为观察氧自由基的间接指标来评价延缓衰老的功能食品的功效。

GSH-Px是机体内广泛存在的一种含硒抗氧化酶。它通过特异性地催化还原型谷胱甘肽对氢过氧化物的还原反应，清除细胞内有害的氧化代谢产物，以使脂质过氧化连锁反应受到阻断，从而起到保护细胞代谢正常进行的重要作用。老年人随着年龄增加，GSH-Px活性逐渐降低，而抗衰老药物大多具有提高体内GSH-Px活性的作用。所以测定GSH-Px的活性已经被公认为评价抗衰老功能食品的重要指标之一。

CAT广泛存在于生物体细胞中。它通过减少对机体有害的H2O2，以降低自由基和过氧化脂质的形成，对机体起着关键的保护作用。研究表明，老年人与老龄动物血液和组织中的CAT活性与年龄呈负相关。所以测定CAT成为研究衰老疾病的又一重要指标。

（3）MAO活性的测定。MAO活性是根据衰老的脑中心学说而建立的指标。MAO系含Fe2+、Cu2+与磷脂的结合酶，主要作用于—CH2、—NH2基团，广泛存在于动物的各种组织，如血浆、脑、肝脏。它能催化不同类型单胺类脱氨生成相应的醛，再进一步氧化成酸，或者使醛转化成醇再进一步代谢。

MAO的生理功能因其所处的不同组织而异：神经组织中的MAO与儿茶酚胺类、5-羟色胺的代谢有关；心血管MAO与酪氨酸羟化酶协同作用，加速肾上腺素的转换，对维持循环稳定有一定的意义；肝脏MAO对各种胺类的生物转化具有重要作用；结缔组织MAO参与胶原纤维成熟最后阶段的架桥过程。

MAO与衰老有密切关系。脑中单胺能神经元调节作用的下降和MAO-B活性的上升，造成了生物化学损害，这是衰老的原因之一。形态学的研究发现，随着衰老，人脑细胞逐渐丧失，神经元的丧失由胶质细胞的增生所补偿。这一过程与胶质细胞中的MAO-B活性随年龄上升相一致，而神经元中的MAO-A活性则随年龄下降。这反映了衰老过程中神经元丧失，而且在衰老或老化的人脑中，与神经元外周胶质细胞消长过程相应的MAO-A与MAO-B的消长，直接影响人脑中单胺能神经元（特别是多巴胺性能与微量胺能神经元）的调节作用，从而出现了生理功能的退化和某些行为的改变。

因为单胺类递质在肝脏内进行降解，所以一种有效的抗衰老功能食品应该只对脑MAO-B活性有明显的抑制作用，但不应该影响肝脏MAO-B的活性，以保证肝脏中单胺类的降解不受影响。

3.人体试食试验

延缓衰老功能食品在人体的功能检测，一般是结合果蝇生存试验和/或哺乳动物生存试验，由便于测定的3种酶（MDA、GSH-Px和SOD）活性来判定。

试验对象应符合以下几个条件：

（1）中老年（45岁以上）男女，无严重的器质性或功能性疾病者，无服药或嗜酒、吸烟者。

（2）要符合《人体试食试验规程》的一切要求，愿意合作。

（3）自身对照时，试验对象不少于30人；设对照组时加倍。对照组须与试验组在年龄及其他方面有严格可比性。

试验对象按推荐剂量食用受试样品，至少持续1个月。对照组食用外形相似的安慰剂。检测试验前后血清中MDA、血中SOD和血中GSH-Px 3种酶活性，同时做一般健康状况的观察与检验，如主诉症状、体征检查、血常规检验、尿常规检验、胸透、心电图、肝功、肾功等。

统计和比较试验数据（试验后比试验前，试验后试验组比对照组）。若MDA活性降低、SOD和GSH-Px活性增高，差异显著，同时动物试验（如果蝇生存试验或哺乳动物生存试验）结果满意，即可判定受试样品对人体有延缓衰老功能；但如缺少动物试验或动物试验结果不满意，则只能判定该受试样品对人体有抗氧化功能，暗示对人体可能有延缓衰老功能。

4.免疫功能的评价

根据衰老的免疫学说及衰老的神经内分泌学说，机体免疫功能的下降是引起衰老的重要原因。所以，测定一种功能食品对机体免疫功能的影响情况，是判断它是否具有抗衰老作用的一个评价指标。