乳酸菌分离实验方法及样品采集来源分析

1. 样品的采集

从湖北古襄阳酒业的窖泥车间选取3个窖池，编号分别为A、B和C，在每个窖池的上层（距地面20 cm）、中层和底层分别挖取100 g左右窖泥，同一窖池的窖泥混合均匀后装入样品瓶中，置于冰盒中运回实验室进行乳酸菌的分离。

2. 窖泥乳酸菌的分离纯化及DNA提取

将窖泥样品10倍梯度稀释后，取3个适宜的梯度涂布于含有1%碳酸钙的MRS固体培养基中，37 °C厌氧培养2 d，选取菌数在30～300的梯度进行菌落形态记录。取有透明圈的单菌落划线，纯化3次之后，进行过氧化氢酶试验和革兰氏染色。将过氧化氢酶试验结果为阴性和革兰氏染色结果为阳性的纯菌株暂定为疑似乳酸菌[9]。使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法对菌株基因组DNA进行提取[10]，并进行琼脂糖凝胶电泳检测。

3. 16S rDNA的PCR扩增

扩增体系：正反向引物各0.5 μL，模板0.5 μL，dNTP 2 μL，10×PCR buffer2.5 μL，Taq酶0.2 μL，超纯水18.8 μL。其中正反向引物为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物为1495R：5′-CTACG GCTACCTTCTTACGA-3′[11]。

扩增程序为：94 °C预变性4 min；94 °C变性45 s，55 °C退火45 s，72 °C延伸1 min 30 s，循环30次；72 °C延伸10 min；4 °C保温[11]。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。将扩增成功的PCR产物进行纯化、连接、转化以及鉴定，并将鉴定出的阳性克隆子的菌液寄往南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。将测出的序列与NCBI数据库进行BLAST同源性比对[12]，以确定其分子学地位，并使用MEGA7.0软件构建系统发育树。

4. 菌株酒精耐受性的测定

将活化3代的菌株分别接种于含乙醇浓度为0%、3%、5%、7%的MRS液体培养基中，在37 °C的条件下培养48 h后，在λ=600 nm处测定其浊度。

5. 橘子酒的制作(www.xing528.com)

将成熟的橘子去皮、分瓣和打浆→添加偏重亚硫酸钾（90 mg/L）→添加0.01%（m/V）果胶酶→用碳酸钠调pH值为6.0，用白砂糖调整糖度为20°Brix→常温放置12 h→添加0.02%（m/V）干酵母→控温发酵（22 °C，6 d）→酒渣分离→按照5×106 CFU/mL的接种量接种乳酸菌→后发酵（18 °C，20 d）→陈酿→澄清→过滤→杀菌→装瓶。

6. 橘子酒滋味品质的评价

参照郭壮的方法进行测定[13]。传感器CAO、AE1、COO、AAE和CTO首先测得参比溶液电势Vr，然后测得橘子酒的电势Vs，在参比溶液中洗涤后，传感器COO、AE1和AAE测得参比溶液电势Vr′。Vs-Vr即为酸、苦、涩、咸和鲜味5个基本味的相对强度；Vr-Vr′即为橘子酒后味A（涩的回味）、后味B（苦的回味）和丰度（鲜的回味）的相对强度。

7. 橘子酒有机酸的测定

将乳酸、草酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸和苹果酸的标准样品用超纯水配置成0.001～3 g/L的梯度，根据有机酸浓度和色谱峰峰面积进行线性拟合。

样品处理：取2 mL样品，加200 μL磷酸，定容到10 mL，混匀后用0.22 μm水相滤膜过滤，备用。

色谱条件：流动相为0.01 mol/L磷酸二氢钾，pH值为2.9，柱温为30 °C，流速为1.0 mL/min，进样体积为10 μL，色谱柱为C18柱（150×4.6 mm，5 μm），检测器为紫外检测器，检测波长为215 nm[14]。

8. 橘子酒理化指标的评价

使用Mega7.0软件（http：//www.megasoftware.net/）绘制系统发育树，其他图均使用Origin 8.6软件（OriginLab Corp，MA，USA）绘制。