实验方法：银染法染色和PCR扩增检测特征条带

1. 窖泥总DNA提取

将窖泥样品取出迅速解冻后，称取1 g，使用土壤DNA提取试剂盒按照说明书进行窖泥总DNA的提取，并使用超微量紫外分光光度计测定所提取的DNA质量。

2. 窖泥细菌16S rRNA的V3区扩增

以提取到的窖泥总DNA为模板，使用引物ALL-GC-V3F与ALL-V3R扩增窖泥样品的16S rRNA的V3区，PCR程序参照Pearce的条件[11]，略有修改：94 °C热启动5 min；94 °C 45 s，58 °C退火45 s，72 °C延伸30 s，35个循环；再72 °C延伸10 min。体系为50 μL：10×PCR buffer，5 μL；dNTP，4 μL；ALL-GC-V3F与ALL-V3R（10 mmol/L），各1 μL；DNA模板，10 ng，加无菌纯水补足50 μL。待PCR结束后，使用琼脂糖凝胶电泳检车PCR产物的质量。

3. 窖泥细菌的DGGE

DGGE的操作参照黄静的方法[14]进行：下层变性胶浓度梯度从上到下是27%～60%，使用轮式手动灌胶系统灌入下层胶后，加入水将下层胶压平，待下层胶凝固后，除去加入的水，灌入分离胶。分离胶不含变性剂，长度为3 cm左右。待上层胶凝固后，小心拔出梳子，将胶板固定好，装入电泳槽，加入0.5×TAE并加热。待电泳液温度升至60 °C后，在每个泳道加入15 μL左右PCR产物。初始电压设置为120 V，待指示剂快速通过上层胶后，将电压调整为80V，电泳时间为16 h。电泳结束后，使用银染法染色，在扫描仪上拍照保存图像，标识出特征条带，并切下来，装入无菌的1.5 mL离心管中，加入50 μL的无菌水，4 °C过夜，以之为模板，使用引物ALL-V3F与ALL-V3R进行PCR扩增，PCR体系与PCR程序参照上述步骤2的方法进行，并将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

4. 条带序列测定与分析

PCR产物的TA克隆步骤参照黄静的方法进行[14]，取上述步骤3得到的PCR产物，进行TA克隆并测序：首先将PCR产物与pMD19-T在16 °C连接90 min，连接后转入大肠杆菌感受态细胞，使用M13F（-47）与M13R（-48）以克隆子为模板进行PCR验证，并进行琼脂糖凝胶电泳检测结果。挑取阳性克隆子送到天一辉远（武汉）生物科技有限公司测序。将获得的序列在NCBI数据库Blast比对，挑取相似度最高的模式菌序列，使用MEGA7.0软件[15]以邻接法构建系统发育树，确定DGGE特征条带序列的系统分类。(www.xing528.com)

5. 乳酸菌16S rRNA的V3区扩增

窖泥乳酸菌的PCR使用带有GC夹子的引物Lac-GC-F与Lac-R，将退火温度设为55 °C[13]，PCR程序的其他条件及PCR体系参照上述步骤2。

6. 窖泥乳酸菌的DGGE

窖泥乳酸菌的DGGE变形梯度设置为30%～60%，其他条件与步骤同上述3。

7. 条带序列测定与分析

具体实验方法与步骤参照上述4。