实验方法：窖泥处理后的样品分析

1. 样品采集及DNA提取 从湖北古襄阳酒业有限公司新旧窖泥车间各选取5个窖池，从窖底取300 g窖泥装入无菌采样袋中，低温运送回实验室，采用E. Z. N. A.®Soil DNA Kit试剂盒进行微生物宏基因组DNA提取。旧窖泥车间窖池窖龄均为30年，由于新厂搬迁，旧窖池已2年未使用，但均填充酒糟并覆盖窖皮泥进行密封。新窖池窖龄为2年，新旧窖池距离约5 km，且深度均为2.2 m。其中退化窖泥组5个样品分别命名为D1、D2、D3、D4和D5，正常窖泥组5个样品分别命名为N1、N2、N3、N4和N5。

2. 细菌16S rDNA序列PCR扩增及高通量测序 扩增体系为：DNA模板10 ng，10×PCR缓冲液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs mix 2 μL，5 U/μL DNA聚合酶0.4 μL，5 μmol/L正向和反向引物各0.8 μL，体系用ddH2O补充至20 μL。扩增条件为：95 °C 3 min，95 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 45 s，35个循环，72 °C 10 min。检测合格的PCR产物寄往上海美吉生物医药科技有限公司，使用Miseq PE300平台进行高通量测序。

3. 序列质控

将下机序列拼接后依照核苷酸标签（barcode）信息划分到各样品，同时将barcode和引物予以切除进而得到高质量的序列。拼接过程中序列应满足如下要求，否则予以删除：重叠区≥10 bp；最大错配比率≤0.2；barcode碱基无错配；引物碱基错配数≤2 bp。

4. 生物信息学分析 采用QIIME（v1.70）平台[12]进行2类窖泥细菌物种分析和多样性评价。主要的处理流程为：① 采用PyNAST校准并把序列排齐[13]。② 采用两步UCLUST法依次按照100%和97%相似性进行无重复的单一序列集和分类操作单元（Operational taxonomic units，OTU）构建[14]。③ 应用ChimeraSlayer去除含有嵌合体序列的OTU[15]。④ 从去除嵌合体的OTU中选取代表性序列，使用RDP（Ribosomal database project，Release 11.5）[16]和Greengenes（Release 13.8）[17]数据库进行序列同源性比对，在门、纲、目、科和属水平上对其分类学地位进行明确。若隶属于某一门或属的样品在10个窖泥样品中的平均相对含量大于1.0%，则将其定义为优势门或属[18]。⑤ 从去除嵌合体的OTU中选取代表性序列，使用FastTree软件绘制系统发育进化树[19]，并对超1指数（Chao1 index）和香农指数（Shannon index）等α多样性指数进行计算[20]。⑥ 基于UniFrac距离[21]进行主坐标分析（Principal coordinate analysis，PCoA）和非加权

组平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）聚类分析，进而完成不同样品间细菌群落结构的β多样性分析。(www.xing528.com)

5. 核酸登录号

序列数据提交至MG-RAST数据库（http：//metagenomics.anl.gov/），登录号为mgp83663。

6. 多元统计学分析

使用Mann-Whiney检验对2类窖泥微生物群落的超1指数、香农指数、优势细菌门和属平均相对含量进行显著性分析；采用多元方差分析（Multivariate analysis of variance，MANOVA）对2类窖泥细菌群落结构差异性进行分析；采用冗余分析（Redundancy analysis，RDA）对与2类窖泥细菌群落结构差异显著相关的关键类群进行甄别；采用欧式距离对2类窖泥细菌群落结构组间差异进行计算。使用Canoco 4.5软件绘制RDA图，使用Matlab 2010b软件绘制热图，使用Mega5.0软件绘制系统发育树，其他图使用Origin 8.6软件绘制。