基于分类学地位的细菌相对含量分析

本研究采用RDP和BLAST同源性序列比对聚类相结合的方法，将所有的序列鉴定为20个门，其中优势门分别为Firmicutes和Actinobacteria，其平均含量分别为93.89%和4.73%。由此可见，隶属于Firmicutes和Actinobacteria的细菌为丢糟窖窖泥中的优势门，其累计含量占98.62%。本研究从丢糟窖窖泥中共鉴定出355个属的细菌，且有10.57%的序列无法将其鉴定到属水平。丢糟窖窖泥中优势细菌属相对含量的比较分析如图3-2所示。

由图3-2可知，纳入本研究的9个丢糟窖窖泥样品中优势细菌属分别为Lactobacillus、Clostridium、Bacillus、Paenibacillus和Thermoactinomyces，其平均相对含量为59.67%、8.28%、5.73%、4.97%和1.29%。由此可见，丢糟窖窖泥中的细菌主要由隶属于Firmicutes的5个属构成，其累计相对含量为79.94%。经配对t检验发现，上部的窖泥乳酸菌相对含量要显著高于底部（t=4.981 0，P=0.038 0）。本研究进一步统计了7 639个OTU在9个丢糟窖窖泥样品中出现的次数，其结果如图3-3所示。

图3-2　丢糟窖窖泥中相对含量大于1.0%的细菌属

图3-3　OTU在9个样品中出现次数统计

由图3-3可知，虽然核心OTU有227个，仅占OTU总数的2.97%，但其包含了278 433条序列，占所有质控后合格序列数的85.89%。在9个样品中仅出现1次的OTU多达5 574个，占OTU总数的72.97%，但其仅包含6 908条序列，仅占所有质控后合格序列数的2.13%。经进一步分析发现，227个核心OTU中有7个OTU的平均相对含量大于1.0%，其累计相对含量为63.30%，由此可见，虽然有少量较为独特的细菌种系型存在于部分窖泥样品中，但丢糟窖窖泥共有大量的细菌类群。丢糟窖窖泥样品中相对含量大于1.0%的核心OTU如图3-4所示。(www.xing528.com)

图3-4　丢糟窖窖泥样品中相对含量大于1.0%的核心OTU

由图3-4可知，7个相对含量大于1.0%的核心OTU中3个隶属于Lactobacillus，平均相对含量分别为37.98%、11.44%和4.68%，各有1个OTU隶属于Bacillus、Paenibacillus和Thermoactinomyces，平均相对含量分别为3.18%、1.10%和1.05%，尚有1个隶属于Thermoactinomycetaceae的OTU无法鉴定到属水平，其平均相对含量为3.87%。本研究进一步选取了核心OTU中的代表性序列和数据库比对结果中可信性比较高细菌种的序列构建了系统发育树，其结果如图3-5所示。

图3-5　核心OTU的系统发育树

由图3-5可知，OTU5759、OTU3587和OTU1849中的代表性序列可以与乳酸杆菌属下的种形成聚类，OTU5562和OTU2370可分别与芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属下的种形成聚类，而OTU1601既可以与Croceifilum又可以与Hazenella形成聚类。虽然使用RDP和BLAST同源性序列比对聚类相结合的方法可以将OTU6475鉴定为高温放线菌属，但通过构建系统发育树发现，其与Kroppenstedtia下的细菌种亦可以形成聚类。究其原因在于，Illumina MiSeq PE300平台测序读长在400 bp左右，无法覆盖16S rRNA序列全长，因而其仅能在“属”水平上对菌微生物的分类学地位进行揭示。