窖泥微生物宏基因组DNA提取方法探究

1. 窖泥采集及微生物宏基因组提取 窖泥样品于2017年4月取自湖北古襄阳酒业有限公司窖泥车间的3个丢糟窖窖池，窖池窖龄均为2年。窖池深度为2.2 m，取样时从每个窖壁的上层（距地面20 cm）、中层和窖底3个位置各取100 g窖泥，共取9个样品，编号分别为1S、1Z、1X、2S、2Z、2X、3S、3Z和3X，其中数字代表窖池编号，S、Z和X分别代表窖池的上层、中层和窖底。样品采集后迅速置于采样箱中尽快运回实验室，使用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit试剂盒对窖泥样品中的微生物总DNA进行提取，以获得大片段、高质量、高浓度的微生物宏基因组DNA。

2. 16S rRNA PCR扩增

以已提取的窖泥中微生物宏基因组DNA为模板，使用特异性测序引物，选择合适的PCR扩增条件，进行PCR扩增。PCR扩增体系：4 μL 5×PCR缓冲液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs mix，0.8 μL 5 μmol/L正向引物，0.8 μL 5 μmol/L反向引物，0.4 μL 5 U/μL DNA聚合酶，10 ng DNA模板，体系用ddH2O补充至20 μL。其中，细菌16S rRNA PCR扩增引物为：V-F 5'-BxxxxxxxACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′（16S rRNA 338-357），V-R 5'-AxxxxxxxGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′（16S rRNA806-1275），引物中片段A和B代表测序识别序列，x代表标签（Barcode）序列，其长度为7个核苷酸序列。PCR扩增条件：95 °C 3 min；95 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 45 s，30个循环；72 °C延伸10 min。

3. PCR产物纯化、定量及MiSeq高通量测序

PCR产物经电泳分析和准确定量后寄往上海美吉生物医药科技有限公司，应用Illumina MiSeq PE300测序平台对产物进行高通量测序。

4. 序列拼接过程中的质控

拼接过程中分别从序列长度、引物和Barcode匹配程度及高质量碱基所占的比例4个方面对MiSeq测序质量进行评价，只有重叠区碱基数≥10 bp、最大错配比率≤0.2、Barcode碱基无错配、引物碱基错配数≤2 bp且切掉Barcode和引物后碱基数≥50 bp的序列才予以保留。

5. 窖泥微生物多样性分析(www.xing528.com)

利用已建立的序数据分析流程和脚本程序进行序列质量控制，预处理合格的全部序列去除前后引物以及Barcode后，使用QIIME分析平台[15]进行序列的生物信息学分析。在使用PyNAST[16]对序列校准排齐后采用两步UCLUST法[17]归并建立分类操作单元（Operational taxonomic units，OTU）并应用ChimeraSlayer[18]去除含有嵌合体序列的OTU序列，继而整合RDP（Ribosomal database project，Release 11.5）[19]和Greengenes（Release 13.8）[20]两个数据库的比对结果，对OTU进行序列同源性比对和种属分类学鉴定，从而明确丢糟窖窖泥中细菌的构成。再使用FastTree软件[21]生成系统发育进化树的基础上对样品中细菌微生物的超1（Chao1）和香农（Shannon）指数进行计算。

6. 优势和核心细菌类群的定义

如果某一细菌类群在3个样品中均存在，则定义为核心细菌类群；如果某一细菌类群在3个样品中的平均相对含量大于1.0%，则我们将其定义为优势细菌类群。

7. 核酸登录号

本研究中所有序列数据已提交至MG-RAST数据库，ID号为mgp343720。

8. 乳酸菌分离及鉴定

将同一窖池不同部位的窖泥混合后，使用生理盐水稀释到-2、-3、-4和-5梯度，涂布到含有1.0%碳酸钙的MRS培养基上，置于DG250厌氧工作站通入三气（85% N2，5% CO2和10% H2）37 °C培养48 h后，选取菌落数在30～300个的平板，根据菌落形态对产有透明圈的潜在乳酸菌菌株进行分离纯化。在采用液氮反复冻融-CTAB法提取潜在乳酸菌菌株基因组DNA的基础上，使用细菌16S rRNA基因扩增引物27F与1492R进行PCR扩增，将扩增产物使用pMD18-T载体连接并转化于DH5 α感受态细胞后挑取阳性克隆子测序。测序得到的序列上传至NCBI网站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列比对，并选取相似度较高的模式菌株序列（≥93%）构建系统发育树，进而确定菌株的系统分类。