窖泥微生物宏基因组DNA提取及高通量测序分析

1. 样品采集及DNA提取

从湖北古襄阳酒业有限公司窖泥车间的4个窖龄为2年的窖池中分上、中、下3个部位进行样品采集，窖池深度为2.2 m，取样时从每个窖壁的上层（距地面20 cm）、中层和窖底3个位置各取100 g窖泥。将同一窖池来源的窖泥混合均匀后装入无菌采样袋中低温运送回实验室，编号分别为GXY1、GXY2、GXY3和GXY4。采用E.Z.N.A.®Soil DNA Kit试剂盒对窖泥中微生物宏基因组DNA进行提取。

2. 细菌16S rDNA序列V4-V5区扩增及高通量测序

扩增体系为：DNA模板10 ng，5 μmol/L正向和反向引物各0.8 μL，5 U/μL DNA聚合酶0.4 μL，2.5 mmol/L dNTPs mix 2 μL，10×PCR缓冲液4 μL，体系用ddH2O补充至20 μL。扩增条件为：95 °C 3 min，95 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 45 s，35个循环，72 °C 10 min。PCR产物检测合格后寄往上海美吉生物医药科技有限公司使用Miseq PE300平台进行高通量测序。

3. 序列质控

将双端序列进行拼接后，根据核苷酸标签（barcode）信息将拼接好的序列划分到各样品，同时去除各条序列中的barcode和引物。在拼接过程中序列需满足以下条件：重叠区≥10 bp；最大错配比率≤0.2；7个barcode碱基不存在错配；引物碱基错配数≤2 bp。

4. 生物信息学分析(www.xing528.com)

使用QIIME（v1.7.0）分析平台[15]按照以下流程进行生物信息学分析：使用PyNAST[16]将序列对齐（align）；采用UCLUST算法[17]，根据100%和97%的相似性将对齐后的序列进行归并，并建立分类操作单元（Operational taxonomic units，OTU）；使用ChimeraSlayer软件[18]进行嵌合体检查，去除含有嵌合体的OTU，同时定义存在所有4个窖泥样品中的OTU为核心OTU；从去除嵌合体的OTU中选取代表性序列，使用RDP（Ribosomal Database Project，Release 11.5）[19]和Greengenes（Release 13.8）[20]数据库在门、纲、目、科和属水平明确其分类学地位，同时计算该OTU在各样品中的相对含量。若隶属于某一门、属或OTU的样品在所有样品中的平均相对含量大于1.0%，则将其定义为优势门、属或OTU。进一步从去除嵌合体的OTU中选取代表性序列，使用FastTree软件[21]绘制系统发育进化树，并对香农指数（Shannon index）和超1指数（Chao1 index）等α多样性指数进行计算。

5. 核酸登录号

Miseq高通量测序数据提交至MG-RAST数据库（http：//metagenomics. anl.gov/），ID号为mgp83537。

6. 乳酸菌的分离鉴定 采用10倍梯度将窖泥样品倍比稀释后，分别涂布于含有CaCO3的MRS琼脂培养基平板中，于厌氧条件下（85% N2，5% CO2及10% H2）37 °C培养48h后挑取有透明圈的且形态不同的菌落进行分离纯化，30%甘油－80 °C保藏备用。参照武俊瑞等人的方法使用十六烷基三甲基溴化铵（Hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取潜在乳酸菌分离株的基因组DNA并进行16S rDNA序列扩增[22]，检测合格的PCR产物送南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定。反馈回的序列在GenBank数据库中进行基本局部相似性比对搜索工具（Basic local alignment search tool，BLAST）同源性比对分析，继而构建系统发育树，进而明确乳酸菌的系统发育地位。

7. 数据统计学分析

使用Mega5.0软件绘制系统发育树；使用在线软件Venny 2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）绘制维恩（Venn）图；其他图均使用Origin 8.6软件绘制。