宏基因组技术在窖泥微生物研究中的应用

宏基因组学也称为环境基因组学、元基因组学、生态基因组学。Handelsman等[62]于1998年第一次将宏基因组（metagenome）定义为“the genomes of the total microbiota found in nature”，即环境中全部微生物群的所有遗传物质，以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间关系为研究目的的研究方法。与传统培养法及高通量测序技术相比，宏基因组测序分析有以下优点：不需要培养微生物，能客观全面地还原菌群结构；测序周期短；测序通量大、灵敏度高，能对样品中总的微生物群落结构进行功能及代谢通路的分析[63-64]。

宏基因组技术的分析步骤为：首先提取环境样品DNA，经克隆转化、构建文库，最后上机测序。通过生物信息学分析，将下机后的原数据去除污染和接头序列、含N碱基序列、质量值小于20的序列、长度小于50 bp的短序列，获得的高质量序列进行序列拼接。获得的数据均进行两方面的分析：一方面进行物种分类学注释，分析种群分布，对不同生境下的种群进行比较分析；另一方面进行功能分析，首先将拼接好的Contigs进行开放阅读框预测，之后利用数据库进行功能注释和代谢通路分析。常用的功能注释数据库有COG、KEGG、Nt、Nr、GO、Swiss-Prot、SEED等。常用的代谢通路数据库包括KEGG、RegulonDB、BioCyc、WikiPathwans、Reactome[64-66]等。(www.xing528.com)

白酒固态发酵是一个复杂的过程，在窖泥中存在着大量难以培养的微生物，因此，通常对于菌群发酵机制及其相互作用知之甚少，而元基因组的方法不需要对菌株进行分离而直接测序，对窖泥微生物研究非常有效。2017年，Tao等[67]通过metagenomics法对绵竹市的浓香型白酒窖泥进行了研究，检测到了脂肪酸链延伸途径中的关键基因，重构了脂肪酸碳链延伸途径，该途径含有己酸合成途径的关键酶，表明窖泥微生物具有以乙醇或丙酮酸为底物合成己酸的能力。另外获取了窖泥微生物中甲烷合成途径中编码产氢酶与乙酸分解酶的基因，表明在甲烷菌与己酸菌之间存在氢转移作用，重构了基于Clostridium、ClostridialclusterIV、Methanoculleus与Methanosarcins种间氢转移作用的己酸合成途径。另外根据分析结果，Clostridialcluster IV，Caloramator，Clostridium，Sedimentibacter，Bacteroides与Porphyromonas等6个菌属构成了窖泥中己酸合成的活性微生物环境，Clostridialcluster IV与Clostridium能直接合成己酸。