窖泥微生物研究中的第二代测序技术

1977年Sanger发明了双末端终止测序法，即第一代测序方法。测序技术不断革新，科研人员在一代测序技术的基础上，开发出的二代测序技术，即高通量测序法逐渐成为目前窖泥中微生物研究的重要手段，在传统发酵食品微生物中得到广泛的应用[49]。高通量测序技术的应用从2006年至今呈现明显的上升趋势。目前常用的二代测序平台主要是以Illumina公司的Solexa平台、ABI公司的SOLiD平台和Roche公司的454平台为代表[50-51]。二代测序测序的基本操作流程主要包括克隆文库制备、DNA片段固定、DNA片段单分子扩增、测序反应、光学图像采集与处理及序列拼接及组装[50]，，具有：通量高（能得到0.035～1800 Gb的数据信息）；准确率高；成本低；试验周期短；相比于传统可培养及其他分子手段，能检测到环境样品中稀有种属，即能全面客观地揭示目标环境中微生物群落信息，同时获得定性及相对定量信息等优势[50-51]，因此被广泛地应用于窖泥及其他样品中微生物的多样性研究。

2017年，Liu等[46]，同时采用DGGE与Illumina MiSeq二代测序技术分别对泸州老窖5年与100年窖泥中的真菌微生物进行了研究。DGGE法仅检测到了样品中12个菌属，而MiSeq法检测到4个菌门（Ascomycota，Zygomycota，Basidiomycota，Chytridiomycota）与111个菌属，所获取的窖泥中的微生物信息量远大于DGGE法：泸州老窖5年与100年样品中检测到Rhizopus，Aspergillus，Phoma等19个核心菌属，5年窖龄窖泥优势菌属为Rhizopus，Phoma，Trichosporoni；100年窖龄优势菌属为Aspergillus，Candida。按照Yilmaz等的观点，自然界中绝大多数或者99%的微生物在实验室难以富集培养生长 [52]，而DGGE由于技术本身的缺陷不能对低于1%的微生物类群进行表征，因此高通量测序法具有天然的优势。

酒窖窖泥环境比较特别，有较高的乙醇含量、较低的pH值及较低的氧气含量，窖泥中微生物群落结构复杂多样。对泸州老窖30年与300年窖龄的窖泥中细菌微生物进行了研究[53]：300年窖泥中古菌主要属于Euryarchaeota，占8.8%～16.6%；30年窖泥中Euryarchaeota仅占0.6%，含量远低于300年窖泥。在30年窖泥中，Firmicutes是优势菌门，占92%以上，主要是乳酸菌Lactobacillus，占90%以上；而300年窖泥中，Firmicutes也作为优势菌门，占到43%以上，主要是乳酸菌Lactobacillus，占22%～41%，远远低于30年窖泥。而Clostridiales在300年窖泥中占到21%～40%，Clostridium占2.6%～4.9%；Clostridiales在300年窖泥中占约2.5%，Clostridium仅占0.35%。可以看出，新老窖池窖泥中微生物群落结构存在显著差异。Hu等[45]对江苏汤沟浓香型白酒优质窖泥、普通窖泥与退化窖泥中细菌微生物进行了分析，发现在退化窖泥有中仅有2个优势菌属：Lactobacillus，Ruminococcus；常规窖泥中有Lactobacillus，Caloramator，Clostridium等12个优势菌属；而优质窖泥中有Lactobacillus，Caloramator，Clostridium等15个优势菌属。随着窖泥质量的增加，检测到Lactobacillus含量显著减少，而Clostridia、Bacteroidia、Methanobacteria及Methanomicrobia等4个菌纲的核心属含量明显增加，表明这4个纲的微生物含量增加及Lactobacillus含量减少有利于提高窖泥的质量。分析后认为，高乳酸含量，低NH4＋、pH值、有机磷含量是导致窖泥退化的外因。(www.xing528.com)

另外胡晓龙等[15]通过网络分析方法分析了微生物群落结构的相关性，从正相关网络图谱中获得了13个hubs，这些hubs与其他微生物间有着很强的相关联系，在这些微生物之间也存在协同作用，有利于窖泥环境中的碳、氮及硫元素循环及窖泥风味物质形成。从负相关网络图谱中共发现3个hubs，包括Lactobacillus、Pediococcus和Streptococcus，3个属是典型的乳酸菌菌属，它们与多种微生物呈负相关关系。这也说明乳酸菌与其他窖泥微生物类群存在着一定的拮抗作用，能抑制其他微生物类群的生长繁殖。窖泥微生物类群之间存在着复杂相互作用关系，认识和解析窖泥中的微生物信息，将有助于人们采取措施有目的干预窖泥中的特定微生物，来提升白酒酒质与白酒生产效率。

虽然通过第二代测序方法比DGGE法获取的信息量更多，对窖泥中微生物的解析更为精细，但事实上二代测序技术并非无懈可击。由于测序读长所限，大部分研究只能以16S rRNA可变区部分区段为扩增、测序靶点，致使对微生物分析鉴定只能停留在“属”水平，甚至“科”水平，不能对环境中微生物群落结构进行精准描述。