PCR-DGGE技术在窖泥微生物研究中的应用

DGGE技术能用于环境中细菌、蓝细菌、古菌、微型真核生物、真菌生物和病毒群落的生物多样性的分析，目前主要研究对象是原核微生物及真菌微生物。原理是在聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）使聚丙烯酰胺凝胶从上到下呈现从小到大的变性梯度，PCR产物沿着化学梯度有不同解链行为，在凝胶的不同位置上停止迁移而分离开来[29]。PCR-DGGE分析微生物多样性的试验流程为：首先是样品总DNA的提取；然后以总DNA为模板进行PCR扩增；制作相应梯度的聚丙烯酰胺凝胶，然后在样品孔添加样品的PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；对聚丙烯酰胺胶进行染色，挑取条带回收，克隆与测序，对聚丙烯酰胺胶进行分析[29-30]。

细菌 16S rDNA 基因含有多个可变区与保守区[5]（图1-1），由于DGGE对大于500 bp的DNA片段分离度较差，通常使用16S rDNA基因中的一个或者两个区段。由于PCR-DGGE技术不需要培养，检测快速，成本低，目前仍然与第二代测序技术同为当前白酒窖泥中微生物研究的主要技术。自从1993年，Muyzer[30]第一次将PCR-DGGE技术引入微生物多样性的研究以后，该技术就在与微生物相关的各个领域得到广泛应用，在白酒窖泥微生物的研究也引入了PCR-DGGE技术（表1-1），且成为白酒窖泥研究的主要研究方法。

图1-1　细菌16S rDNA基因结构[5]

表1-1　白酒窖泥中微生物的研究方法(www.xing528.com)

续表

2014年，Ding等[34]使用DGGE法对泸州老窖不同窖龄的人工窖泥中微生物进行了研究：共检测到2个细菌菌门，分别是Proteobacteria和Firmicutes，检测到9个菌科。样品中的主要微生物类群是Clostridiaceae，Lactobacillaceae。Clostridiaceae占总微生物的46.2%。Lachnospiraceae微生物仅在新窖泥中出现，而在3年与4年窖龄窖泥中消失；而Ruminococcaceae相反，在4年窖龄窖泥中出现，而在新窖泥中消失。2013年，Zheng等[23]对泸州老窖20年窖龄与300年窖龄窖泥的分析表明，20年窖泥主要类群为Lysinibacillus与Clostridium；300年窖泥主要类群为Lysinibacillus，Soilbacillus，Clostridium，不同窖龄窖泥中微生物存在显著差异。2015年，胡晓龙[35]等还专门针对窖泥中己酸梭菌16S rRNA基因序列的V4和V5可变区，设计了DGGE检测引物对（SJ-F和SJ-R），能特异性解析窖泥中梭菌菌群多样性，能灵敏且准确地对窖泥梭菌菌群组成及多样性进行研究。

虽然目前PCR-DGGE具有不需要培养，且检测快速，成本低等一系列优势，是白酒窖泥微生物群落结构的主要研究方法，但仍具有一些缺陷[48]：仅能检出样品中含量超过1%的微生物，对一些含量低但可能具有重要功能的微生物不能有效地检测；DGGE图谱中条带信息量低，可能会低估窖泥中优势微生物的多样性；PCR产物片段长度大于500 bp的序列不适用于该法，因此在以后可能会被高通量测序技术取代。