抗氧化乳酸菌对腌干鱼脂质氧化的机理研究

（一）乳酸菌对腌干鱼脂质组分的影响研究

1.发酵腌干鱼与传统腌干鱼极性脂质（PL）的种类及总量的变化比较

分别从蓝圆鲹及带鱼的3种样品（分别为原料、传统腌干样品、发酵腌干样品）中提取的粗脂质经过ESI-MS/MS检测得到的12种脂质组分的总含量如表5-67所示，由Tukey HSD检验比较每种鱼三组数据间的显著差异。在蓝圆鲹中，原料（L）及传统腌干样品（LC）除了PG和ePS，其他种类的脂质组分都表现出显著差异（p<0.05），说明传统腌干加工对大部分脂质组分有显著影响，采用混合乳酸菌发酵的腌干样品（LC-J）中的脂质组分，与LC相比没有显著差异（p>0.05）的脂质组分有PC、PE、PI、PS、PG、LPE、ePC、ePE、ePS这9种，表明了混菌发酵的方法不能消除腌干加工对蓝圆鲹脂质组分的影响。在带鱼中，原料（D）及传统腌干样品（DC）间，除了PE和PI，其他种类的脂质组分都表现出显著差异（p<0.05），也说明传统腌干加工对带鱼的大部分脂质组分都有显著影响，而采用混合乳酸菌发酵的腌干样品（DC-J）中的脂质组分与DC相比，没有显著差异（p>0.05）的组分却只有PI和LPE，其他10种组分都呈显著差异（p<0.05），表明了混菌发酵的方法可以消除腌干加工对带鱼中大部分脂质组分的影响，这与蓝圆鲹有很大的区别，且在D和DC-J之间，差异不显著的组分有PI、PS、PA、PG、ePC和ePS这6种，表明混菌发酵能使带鱼的大部分脂质组分在腌干加工前后变化不显著（p>0.05）。

综上所述，传统腌干加工对红、白肉鱼的脂质组分影响都比较显著，以带鱼为代表的白肉鱼的大部分脂质组分在原料（D）和乳酸菌混菌腌干样品（DC-J）间没有表现出显著差异，而以蓝圆鲹为代表的红肉鱼则在传统腌干（LC）与乳酸菌发酵腌干加工样品间（LC-J）没有显著差异，说明乳酸菌对白肉鱼的PL总含量的影响要显著高于红肉鱼。

表5-67　乳酸菌发酵腌干与传统腌干蓝圆鲹及带鱼中各种极性脂质（PL）总含量的比较

2.乳酸菌影响的主要极性脂质

ESI-MS/MS灵敏度极高，6种样品中总共检测出240种左右的极性脂质，但本章只考察腌干加工过程对其含量有极其显著影响（p<0.001）的脂质组分（蓝圆鲹和带鱼中分别为109种及59种），其含量的比较分别显示于图5-111～图5-119中，其中蓝圆鲹为图a，带鱼为图b。

3.乳酸菌对蓝圆鲹及带鱼腌干加工中主要卵磷脂（PC）的影响

为了考察乳酸菌对蓝圆鲹及带鱼腌干加工中主要PC的影响，分别采用传统腌干法和乳酸菌发酵腌干法对两种鱼进行加工，并与原料一起比较PC含量的差异，结果显示于图5-111中。图5-111a显示了乳酸菌对蓝圆鲹的22种PC含量的影响，经过Tukey HSD检验比较后，原料（L）、传统腌干（LC）和乳酸菌发酵腌干（LC-J）样品中含量没有显著差异（p>0.05）的PC有C34：3、C34：2、C34：1、C36：3、C36：2和C38：5，另外除了C38：6、C40：7、C40：4和C44：3，其余12种PC含量在原料（L）和传统腌干（LC）样品间差异显著（p<0.05），表明传统腌干对蓝圆鲹所考察的大部分PC有显著影响。仅有C30：0和C44：9在L和LC-J间没有显著差异（p>0.05），而C32：0、C34：0、C38：4、C40：6、C40：5、C44：11和C44：10这7种PC含量则在LC和LC-J间没有显著差异（p>0.05），说明乳酸菌对蓝圆鲹腌干加工的大部分PC影响不显著（p>0.05）。图5-111b则显示了乳酸菌对带鱼的14种PC含量的影响，经过Tukey HSD检验比较后，除了C44：9，其他13种PC的含量在原料（D）、传统腌干（DC）和乳酸菌发酵腌干（DC-J）间都有显著差异（p<0.05），这13种PC的含量都在D和DC间存在显著差异（p<0.05），表明传统腌干对所考察的带鱼的几乎所有PC含量都有显著影响，其中却有C30：0、C32：0、C34：3、C34：0、C42：4、C42：2和C44：8这7种PC含量在D和DC-J间没有显著差异（p>0.05），表明乳酸菌对带鱼腌干加工中变化显著的大部分PC的影响可降低到和原料差异不明显的程度。因此，在腌干加工中，PC含量在以带鱼为代表的白肉鱼中的变化比以蓝圆鲹为代表的红肉鱼显著，但乳酸菌对白肉鱼腌干加工中PC含量的影响却比红肉鱼显著，可使白肉鱼中大部分PC的含量表现为在腌干加工后与原料中的含量差异不显著（p>0.05）。

图5-111　乳酸菌发酵腌干与传统腌干及原料蓝圆鲹及带鱼中卵磷脂（PC）含量的比较

4.乳酸菌对蓝圆鲹及带鱼腌干加工中主要脑磷脂（PE）的影响

乳酸菌对蓝圆鲹及带鱼腌干加工中主要脑磷脂（PE）的影响如图5-112所示。图5-112a显示了乳酸菌对蓝圆鲹的22种PE含量的影响，经过Tukey HSD检验比较后，除了C36：1，其他21种PE含量在L和LC间差异显著（p<0.05），表明传统腌干对蓝圆鲹所考察的大部分PE有显著影响；而这21种PE中，除了C38：6、C38：3、C40：3和C42：7，其他17种PE的含量在LC和LC-J间没有显著差异（p>0.05），表明乳酸菌对蓝圆鲹腌干加工的大部分PE的影响不显著（p>0.05）。图5-112b所列的带鱼的7种PE中，仅有C38：5的含量在L和LC间差异不显著（p>0.05）；余下的6种PE中，有C36：5、C40：5、C42：10和C42：8这4种在L和LC-J间没有显著差异（p>0.05），而与LC有显著差异（p<0.05），表明乳酸菌对带鱼腌干加工的大部分PE的影响较显著（p<0.05），对带鱼腌干加工中变化显著的大部分PE的影响可降低到和原料差异不明显的程度。因此，乳酸菌对红、白肉鱼腌干加工中PE含量的影响与PC的相似。

图5-112　乳酸菌发酵腌干与传统腌干及原料蓝圆鲹及带鱼中脑磷脂（PE）含量的比较

5.乳酸菌对蓝圆鲹及带鱼腌干加工中主要磷脂酰肌醇（PI）的影响

图5-113为乳酸菌对蓝圆鲹及带鱼腌干加工中主要磷脂酰肌醇（PI）含量的影响。图5-113a所示的蓝圆鲹6种PI中，除了C36：5，其余全部在L和LC间差异显著（p<0.05），而这5种PI中，除了C34：2，其余4种PI含量在LC和LC-J间差异不显著（p>0.05），表明了以蓝圆鲹为代表的红肉鱼中，腌干加工对PI含量影响显著，而乳酸菌却未能消除这种影响。图5-113b显示了乳酸菌对带鱼主要PI含量的影响，在7种PI中，有4种PI含量在D和DC之间差异显著，分别为C34：2、C38：6、C40：6和C40：0，而其中有两种PI含量在DC-J和D间差异不显著，说明传统腌干对以带鱼为代表的白肉鱼PI含量的影响不如红肉鱼，但乳酸菌腌干加工对PI含量变化的影响，在白肉鱼中比在红肉鱼中略明显。

图5-113　乳酸菌发酵腌干与传统腌干及原料蓝圆鲹及带鱼中磷脂酰肌醇（PI）含量的比较

6.乳酸菌对蓝圆鲹及带鱼腌干加工中主要磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酸（PA）及磷脂酰甘油（PG）的影响

乳酸菌对磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酸（PA）及磷脂酰甘油（PG）在蓝圆鲹及带鱼腌干加工中的影响，如图5-114所示。乳酸菌对蓝圆鲹上述极性脂质的影响如图5-114a所示，3种PS、5种PA和3种PG中，含量都在L和LC间存在显著差异（p<0.05），而有2种PS（C36：1和C40：6）、1种PA（C36：2）及全部PG的含量在LC和LC-J间无显著差异（p>0.05），说明乳酸菌对PS和PA含量在红肉鱼腌干加工中的影响比对PG含量的影响更显著。图5-114b表示了乳酸菌对带鱼PS、PA和PG的影响，在所考察的2种PS、2种PA和1种PG中，含量都在D和DC间存在显著差异（p<0.05），只有1种PS（C44：12）的含量在LC和LC-J间无显著差异（p>0.05），说明乳酸菌在带鱼腌干加工中的影响比在蓝圆鲹中明显。

图5-114　乳酸菌发酵腌干与传统腌干及原料蓝圆鲹及带鱼中磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酸（PA）及磷脂酰甘油（PG）含量的比较

7.乳酸菌对蓝圆鲹及带鱼腌干加工中主要溶血卵磷脂（LPC）的影响

图5-115为乳酸菌对蓝圆鲹及带鱼腌干加工中主要溶血卵磷脂（LPC）含量的影响。图5-115a为蓝圆鲹的情况，总共考察了11种LPC，全部的含量都显示在L和LC间存在显著增加（p<0.05），而有5种LPC，乳酸菌腌干发酵后（LC-J）含量显示出与传统发酵间（LC）的显著差异（p<0.05），分别为C16：0、C18：2、C18：0、C20：4和C20：2，其余6种则无显著差异（p>0.05），几乎各占一半，后者略占优势，表明乳酸菌对部分LPC在蓝圆鲹的腌干加工中有显著影响。图5-115b显示的是带鱼的情况，7种LPC含量全部在D和DC间显著增加（p<0.05），且所有的LPC含量在DC和DC-J间显示出显著降低（p<0.05），说明乳酸菌能抑制全部LPC含量的显著增加，其中C20：1和C20：0的含量可回复到原料（D）的水平。

图5-115　乳酸菌发酵腌干与传统腌干及原料蓝圆鲹及带鱼中溶血卵磷脂（LPC）含量的比较

8.乳酸菌对蓝圆鲹及带鱼腌干加工中主要溶血脑磷脂（LPE）的影响

图5-116表示乳酸菌对蓝圆鲹及带鱼腌干加工中主要溶血脑磷脂（LPE）含量的影响。乳酸菌对蓝圆鲹的4种LPE含量的影响如图5-116a所示，除了C20：4，其余3种LPE含量都在L和LC间差异显著（p<0.05），但仅有C16：0一种LPE含量在LC和LC-J间存在显著差异（p<0.05），说明乳酸菌对蓝圆鲹腌干加工中的大部分LPE含量的影响不显著。图5-116b所示带鱼的情况中，3种LPE都在D和DC间以及DC和DC-J间存在显著差异（p<0.05），说明乳酸菌对带鱼腌干加工中的全部LPE含量的影响显著程度高于蓝圆鲹。

图5-116　乳酸菌发酵腌干与传统腌干及原料蓝圆鲹及带鱼中溶血脑磷脂（LPE）含量的比较

9.乳酸菌对蓝圆鲹及带鱼腌干加工中主要醚连接卵磷脂（ePC）的影响

图5-117表示乳酸菌对蓝圆鲹及带鱼腌干加工中主要醚连接卵磷脂（ePC）含量的影响。图5-117a所示的蓝圆鲹20种ePC中，有3种ePC的含量在L、LC及LC-J间都无显著差异，分别是C32：0、C36：4和C40：3，余下的17种ePC中，其中6种C32：2、C32：1、C36：3、C36：2、C38：4和C38：1的含量在L和LC间差异不显著（p>0.05），但在LC-J有显著增加（p<0.05），其余下11种ePC中，有7种ePC的含量在LC与LC-J间差异不显著，仅有4种差异显著，分别是C34：2、C34：0、C38：6和C40：2。图5-117b所示带鱼的情况中，全部的9种ePC的含量都在D和DC间以及DC和DC-J间存在显著差异（p<0.05），表明传统腌干对带鱼中ePC含量的影响程度比对蓝圆鲹的深，并且乳酸菌对腌干加工中ePC含量在带鱼中也比在蓝圆鲹中的影响更显著。

图5-117　乳酸菌发酵腌干与传统腌干及原料蓝圆鲹及带鱼中醚连接卵磷脂（ePC）含量的比较

10.乳酸菌对蓝圆鲹及带鱼腌干加工中主要醚连接脑磷脂（ePE）的影响

图5-118表示乳酸菌对蓝圆鲹及带鱼腌干加工中主要醚连接脑磷脂（ePE）含量的影响。图5-118a所示的蓝圆鲹8种ePE中，仅有2种ePE的含量在L和LC间无显著差异（p>0.05），分别是C36：1和C40：4，有5种ePE的含量在LC和LC-J间差异不显著（p>0.05）；仅有2种ePE的含量在LC和LC-J间有显著差异（p<0.05），分别是C38：5和C40：6。图5-118b所示带鱼中，3种ePE的含量都在D和DC间以及DC和DC-J间存在显著差异（p<0.05），表明传统腌干对带鱼中ePE含量的影响程度比对蓝圆鲹的深，并且乳酸菌对腌干加工中的ePE含量的影响在带鱼中也比在蓝圆鲹中更显著。

图5-118　乳酸菌发酵腌干与传统腌干及原料蓝圆鲹及带鱼中醚连接脑磷脂（ePE）含量的比较

11.乳酸菌对蓝圆鲹及带鱼腌干加工中主要鞘磷脂（SM）的影响

鞘磷脂（SM）为结构上由鞘氨醇取代甘油，从而区别于前述所有甘油磷脂的另外一种极性脂质。图5-119表示乳酸菌对蓝圆鲹及带鱼腌干加工中主要鞘磷脂（SM）含量的影响，蓝圆鲹和带鱼各考察4种。图5-119a所示的蓝圆鲹中，仅有C24：0这1种SM的含量在L、LC及LC-J间都无显著差异（p>0.05），而剩余的SM，仅有C22：1的含量在LC和LC-J间有显著差异（p<0.05）。图5-119b所示带鱼中，有3种SM的含量都在D和DC间以及DC和DC-J间存在显著差异（p<0.05），表明传统腌干对带鱼中SM含量的影响程度比对蓝圆鲹的深，并且乳酸菌对腌干加工中SM含量的影响，在带鱼中也比在蓝圆鲹中更显著。

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图5-119　乳酸菌发酵腌干与传统腌干及原料蓝圆鲹及带鱼中鞘磷脂（SM）含量的比较

12.乳酸菌对蓝圆鲹及带鱼腌干加工中主要甘油三酯（TAG）的影响

甘油三酯（TAG）是区别于上述极性脂质的一类中性脂质，是鱼类脂质的重要组成部分，采用ESI-MS/MS的方法，在传统腌干加工过程中，蓝圆鲹及带鱼中分别检测出42种及41种TAG。在腌干加工过程中，蓝圆鲹中受到极显著影响（p<0.001）的有OPPa、PaOL、OPaO、SPaO、OPO、LPS、PSO、SPS、APL、DPP、APO、PSA、OOL、PSEt、OOO、LSO、OSO、SSO、SSS、DPS、AOO、ASO、OSEt和OSEd等24种TAG，带鱼则有MPO、PPPa、PaPaO、LPPa、OPPa、LPP、OPP、EPPa、EPP、APP、OPaO、LPO、SPaO、OPO、LPS、PSO、SPS、APL、APO、PSA、OOL、PSEt、OOO、LSO、OSO、SSO、AOO、OSEt和OSEd等29种TAG，其中有19种是两种鱼共有的。本章重点考察乳酸菌混合发酵法对这些TAG在腌干加工中的影响并得到图5-120。图中TAG以代号表示并列于表5-68，且每种TAG由构成其碳架的3种脂肪酸代表的字母表示，字母所代表的脂肪酸列于表注。图5-120a所示的蓝圆鲹的24种TAG中，除了L1（OPPa），其余23种TAG都在L和LC间有显著差异，说明腌干加工对蓝圆鲹中几乎所有的TAG含量都有显著影响，而接种乳酸菌混合发酵后，LC-J与LC间却只有3种TAG的含量存在显著差异（p<0.05），分别为L3（OPaO）、L8（SPS）及L13（OOL），其他21种TAG的含量无显著差异（p>0.05），说明乳酸菌对蓝圆鲹腌干加工中的TAG含量变化的影响不大，并未显著改变大部分TAG的含量。图5-120b所示的带鱼的29种TAG中，全部呈现一样的趋势，即传统腌干样品（DC）与原料（D）相比，TAG含量全部显著增加（p<0.05），而加入混合乳酸菌发酵后的腌干样品（DC-J）中，TAG含量则呈现出和原料（D）中无显著变化（p>0.05），但和DC中的TAG含量有显著差异（p<0.05），说明乳酸菌能使带鱼中所考察的所有TAG的含量回复到原料时的水平，可有效地防止TAG含量的显著变化。由此可见，乳酸菌对腌干加工中TAG含量的作用，在红、白肉鱼中几乎完全相反。

图5-120　乳酸菌发酵腌干与传统腌干及原料蓝圆鲹及带鱼中甘油三酯（TAG）含量的比较

表5-68　蓝圆鲹及带鱼中TAG的种类、代号及样品来源

注：TAG中脂肪酸代号：肉豆蔻酸（myristic，M，C14：0）、软脂酸（palmitic，P，C16：0）、硬脂酸（stearic，S，C18：0）、油酸（oleic，O，C18：1）、亚油酸（linoleic，L，C18：2）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic，EPA，E，C20：5）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic，DHA，D，C22：6）、花生四烯酸（arachidonic，A，C20：4）、棕榈油酸（palmitoleic，Pa，C16：1）、花生三烯酸（eicosatrienoic，Et，C20：3）及附子脂酸（eicosadienoic，Ed，C20：2）。

（二）乳酸菌抗氧化酶及胞外多糖抗氧化机理

1.乳酸菌抗氧化酶活性分析

9株乳酸菌的三种抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）的活性列于表5-69。三种抗氧化酶都能在9株乳酸菌中检测出来，总体而言，活性最高的是SOD酶，其次是GSH-Px酶，活性最低的是CAT酶。Tukey-Kramer HSD双重比较分析表明，SOD酶活在9株乳酸菌间没有显著差异（p>0.05），而GSH-Px和CAT酶活在9株乳酸菌间却存在显著差异（p<0.05）。

表5-69　乳酸菌抗氧化酶活性

注：同一列数据标注不同字母表示酶活在不同菌株间存在差异。

SOD酶具有较强的自由基清理能力和还原性，它可以将机体产生的O-2转化为氧化活性较小的H2O2和O2，因此，SOD酶在机体抗氧化系统中的作用至关重要。对于SOD酶而言，L21的酶活力最高且达到44.28U/mg，L4的酶活力最低，仅为9.44U/mg。

GSH-Px酶则可将SOD酶转化生成的H2O2进一步转化为无毒的水分子和GSSG。GSH-PX酶在9株乳酸菌中，L4的活力最高，达到15.26U/mg，而最低为R，仅有1.06U/mg。根据酶活的差异显著性分析结果可知，L4、L21、L25和L11这4株菌的酶活无显著差异（p>0.05），且活性较高；L8、L13、L15及b这4株菌之间的酶活也无显著差异（p>0.05），但酶活性较低。

CAT酶在体内发挥的抗氧化作用与GSH-PX酶的作用相当，其可将机体代谢产生的H2O2转化为水分子和氧气，且功能比GSH-PX酶更强。由表5-69中9株乳酸菌的CAT酶的差异显著性分析结果可知，L8和L21的酶活性之间没有显著差异（p>0.05），且酶活较高；其次是L11、L13、L15及L4，这4株菌的酶活也无显著差异（p>0.05）；L21的CAT酶活力最高，达到1.23U/mg，而b的酶活最低，只有0.13U/mg。

综上分析可知，L21的两种抗氧化酶（SOD和CAT）的活性皆为最高，而L4的GSHPX酶活也最高，两株菌都分离自腌干鱼。由前述对7株菌的抗氧化特性的研究可知，对于抗脂质过氧化率、 ·OH自由基清除率及还原力实验中，无论是发酵上清液还是胞内提取物，排名前三的都是L4、L11及L21，且与其他菌株存在显著差异（p>0.05），说明这三株菌的抗氧化能力最强，而其中两株的SOD、GSH-Px、CAT酶活性为最高，说明乳酸菌抗氧化能力的强弱主要基于抗氧化酶的活性。购买的商业化乳酸菌b和R，仅在SOD酶中体现出较高的活性。有研究比较了发酵乳杆菌、乳酸乳球菌、噬酸乳杆菌和瑞士乳杆菌这4种乳酸菌的抗氧化酶活力，胞内提取物的SOD酶活力在15.52～49.96 U/mg之间，而GSH-PX酶活在10.73～14.72 U/mg之间，与本章的研究结果基本相符。有学者分析了人源乳酸菌胞内提取物的抗氧化酶活性，其SOD酶活在10U/mg以内，而GSH-PX酶活则在5～25 U/mg之间，其中有3株发酵乳杆菌，2株干酪乳杆菌和1株屎肠球菌。说明不同来源和亚种的乳酸菌，其抗氧化酶活性差异较大，并且各菌株的抗氧化酶之间也没有必然联系，因此可能存在另外的抗氧化机理。前述研究结果表明，发酵上清液的三组抗氧化指标的结果皆远高于胞内提取物，黄玉军等的研究也表明，乳酸菌发酵液的抗氧化酶活性显著高于胞内提取物，说明乳酸菌的抗氧化活性物质主要分布在发酵上清液中。而另有研究表明，乳酸菌的胞外多糖（EPS）具有显著的抗氧化能力，因此本研究还提取了乳酸菌发酵液的胞外多糖进行了抗氧化机理的研究。

2.乳酸菌胞外多糖产量及纯度分析

采用苯酚-硫酸法测定9株乳酸菌EPS中的糖含量以明确产量较高的菌株，葡萄糖（Glu）含量与其吸光度值呈现良好的线性关系，其线性回归方程为：y=0.012x-0.005，拟合度R2=0.996。根据样品的吸光度值和回归方程可求出胞外多糖的产量，再根据糖所占的胞外多糖粗品的质量比可求出多糖的百分含量，即纯度。9株乳酸菌发酵上清液提取胞外多糖的产量和纯度如图5-121所示。

由Tukey-Kramer HSD双重比较分析，胞外多糖的产量和纯度在9株乳酸菌间都存在显著差异（p<0.05）。就胞外多糖的产量而言，L11的最高，为50.33mg/L，且与其他8株菌胞外多糖的产量皆存在显著差异（p<0.05）；其次为L25；L8、L21和R这3株菌的胞外多糖产量无显著差异（p>0.05），且含量较高； L4、L13、L15及b的胞外多糖产量差异也不显著（p>0.05），且含量最低。9株菌胞外多糖的产量介于5.71～50.33mg/L之间。从发酵牛奶和蔬菜中筛选的产胞外多糖的多株乳酸菌中，产量最高的是短乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，分别为141.32 mg/L、127.00 mg/L和189.95 mg/L，但大部分乳酸菌的胞外多糖产量都在100mg/L以内；另外从新疆酸马奶中分离的干酪乳杆菌的胞外多糖产量在80～120mg/L之间，说明本文从腌干鱼中分离的7株乳酸菌及2株商业乳酸菌的胞外多糖产量并不是很突出，但自行分离的菌株的胞外多糖产量优于商业乳酸菌。就胞外多糖的纯度而言，L21的最高，为56.16%，且与其他8株菌胞外多糖的纯度皆存在显著差异（p<0.05）；其次为L4、L8、L11和L25，这4株菌的胞外多糖纯度无显著差异（p>0.05），且纯度较高；接着为R； L13、L15及b的胞外多糖产量差异也不显著（p>0.05），但纯度最低。9株菌胞外多糖的纯度介于2.43%～56.16%之间。据研究16种微生物胞外多糖的糖含量（纯度）介于54.2%～94.7%之间，表示胞外多糖粗品除含有糖类外，还含有如多肽、蛋白质等其他杂质。本文的9株菌纯度最高的仅达到56.16%，因此有必要作进一步的纯化。由于9株菌的胞外多糖产量和纯度都不算特别突出，因此需再进一步考察胞外多糖是否具有抗氧化特性，以明确9株菌主要的抗氧化机理。

图5-121　乳酸菌胞外多糖产量及纯度比较

注：同一图形中不同的字母a～d及A～D表示菌株间存在显著差异。

3.9株乳酸菌胞外多糖的抗氧化能力分析

乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生长代谢时分泌到细胞壁外的一类多糖，其相对分子质量在4.0×104到6.0×106之间。胞外多糖是食品级的添加剂，将其添加剂食品中不仅可改善食品风味，且对人体健康有益，有帮助治疗肠道功能紊乱、维持肠道菌群平衡的功效。其机理是它的抗氧化性质可以抗肿瘤、增加免疫系统能力和降低血压和胆固醇。实验考察了9株乳酸菌中提取的胞外多糖的抗氧化特性，结果列于表5-70中。其中，L21、L13和L8的胞外多糖具有·DPPH自由基清除能力，且能力最强的是L21，达到42.36%；还原力较强的三株菌的胞外多糖分别是L25、L13和L21，·OH自由基清除率最高的三株菌是L8、L21和L25。综合三项分析，L21和L13所产的胞外多糖抗氧化能力较强。近年来，国内外学者都开始关注乳酸菌胞外多糖是否有抗氧化活性，并通过大量实验证明其具有抗氧化活性。Yan用乳酸菌的无细胞做实验，发现其具有还原性；Lee从一种蘑菇Hypsizigus marmoreus中分离乳酸菌并提取胞外多糖，发现其具有抗脂质氧化、金属离子螯合的性质。Ke从乳酸乳球菌中提取出一种胞外多糖，当它的质量浓度为1.2mg/mL时，·DPPH的清除率达到46.83%，而·OH的清除率达到了76.60%。本研究中的干酪乳杆菌（L21）也达到了类似的·DPPH清除率，而·OH自由基清除率略低。对比菌株胞外多糖和菌体细胞及发酵上清液的抗氧化特性，发现L21的胞外多糖的·OH自由基清除率远远高于发酵上清液，但还原力仅高于菌体细胞，而L13的胞外多糖则两项指标都高于发酵上清液和菌体细胞。说明乳酸菌发酵上清液的抗氧化特性主要由胞外多糖体现出来。虽然腌干鱼分离的乳酸菌胞外多糖的产量和纯度不算突出，但是发酵上清液的抗氧化特性主要由胞外多糖体现出来。由此也证明了乳酸菌的抗氧化能力，一方面是由于一些菌株的细胞内存在的抗氧化酶（SOD、GSH-Px和CAT），另一方面是由于一些菌株细胞外分泌并释放到发酵上清液中的胞外多糖本身具有较强的抗氧化活性（·DPPH自由基清除率、还原力及·OH自由基清除率）。综合9株乳酸菌而言，腌干鱼中分离纯化的干酪乳杆菌（L21）的抗氧化酶活性最强，提取的胞外多糖纯度最高且胞外多糖产量不低，并具有较强的抗氧化能力，因此，有进一步考察其胞外多糖结构的必要。

表5-70　乳酸菌胞外多糖的抗氧化能力

4.L21的胞外多糖粗品中单糖组成的UPLC分析

采用柱前衍生UPLC法对胞外多糖粗品的单糖进行了分析。此方法可以比较自由地选择反应条件，如，不容易存在反应动力学的限制，能够降低或消除衍生化副产物的干扰，可以多步反应，可选择的衍生化试剂范围较广且不需要复杂的仪器设备等。本研究采用PMP衍生法，其目的是可以使单糖带上紫外线吸收基团；操作简便，大部分杂质能够通过萃取的方式除去，就算残留少量杂质，其出峰时间也远早于衍生物的时间，弥补了柱前衍生法的不足。

图5-122为空白培养基的色谱图，表明除了PMP外，在1.82～2.54min之间还形成了3个小峰，此外没有产生任何单糖衍生峰。图5-123为8种单糖标准品的色谱图，Man、Rha、Lac、Glu、Gal、Ara、Xyl和Fuc的保留时间分别为2.54min、3.50min、4.05min、4.92min、5.25min、5.85min、6.18min和7.23min。PMP衍生杂质（< 1min）与单糖衍生物（> 2min）的保留时间的差距，可使样品得到有效分离。图5-124表示L21菌株胞外多糖的色谱图，表明包含有Man、Rha、Glu和Gal，分别于2.53min、3.36min、4.93min和5.16min出峰，虽然空白培养基在2.54min也形成了小峰，可能含有少量Man，但L21的胞外多糖中的Man含量明显高于空白培养基。有研究表明，尽管乳酸菌胞外多糖的种类很多，但它们的单糖组成还是比较简单的，一般会含有D-Gal、D-Glu、L-Rha，但三者的比例不尽相同，例如从S.thermophilusBTC和S.thermophilus 480这两株菌提取的胞外多糖就不含有Rha，从Lb.paracasei 34-1提取的胞外多糖只含有Gal，与本文的研究基本相符。同时，从图谱中可看出Glu、Man占的相对含量最大，并有小部分Gal，Glu、Man、Gal皆为己糖，三者的比例已超过50%。

图5-122　空白培养基的PMP衍生产物的UPLC色谱图

图5-123　8种单糖混合标准品（0.5mg/mL）PMP衍生产物的UPLC色谱图

图5-124　L21菌株胞外多糖粗品PMP衍生产物的UPLC色谱图

5.L21的胞外多糖中单糖组成的红外光谱分析

L21的胞外多糖组成的红外光谱图如图5-125所示。在3431cm-1处出现强吸收峰，该峰多糖分子中羟基和分子内或分子间氢键的伸缩振动峰，在2945cm-1处出现了为C—H的伸缩振动吸收峰，这两个吸收峰是多糖类物质的特征峰。在1635cm-1处的吸收峰为—COO—中C═O非对称伸缩振动或为C═C或C═N或结晶水的吸收峰。本文只在1076cm-1、1122cm-1处出现两个峰。在1398cm-1处的吸收峰为C—H的变角振动吸收峰；在937～1122cm-1处的强吸收峰是由C—O—C环内醚中C—O的伸缩振动引起的。在红外吸收光谱上1333～400cm-1区域中的谱带特别密集，通常1200～950cm-1被认为是胞外多糖的指纹区：若含吡喃糖环，在1200～1000cm-1应存在三个吸收峰；若含呋喃糖环，在相应区域只出现两个峰。本研究在1100cm-1附近存在3个强吸收信号（1076cm-1、1122cm-1和1242cm-1），可以归为吡喃环的伸缩振动峰；硫酸基的S═O伸缩振动在1240～1230cm-1处有吸收峰等，说明L21的胞外多糖中也可能含有硫酸基。另外，在图中信号较强的1647cm-1处的吸收峰应为酰胺键中羰基的伸缩振动，其中的蛋白可能以结合态存在。

很多的研究表明乳酸菌常产生杂聚多糖，本研究结合UPLC与红外光谱的分析结果可知，LC产的胞外多糖为一种至少含有甘露糖（mannose，Man）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、葡萄糖（glucose，Glu）和半乳糖（galactose，Gal）4种单糖，以吡喃糖为主，可能含有硫酸基团并与蛋白结合的杂聚多糖。

图5-125　 LC的胞外多糖组成的红外光谱图