抑制脂质过氧化功能微生物的挖掘及特性分析

（一）乳酸菌发酵特性分析

作为腌干鱼制品的发酵剂需同时满足耐盐、不产H2S、H2O2、黏液以及还原酶阴性等条件，试验以腌干鱼制品发酵剂的要求为筛选标准，将分离自传统腌干鱼的29株乳酸菌进行发酵特性分析，其结果如表5-53所示。符合耐8%NaCl、耐10℃和45℃；产H2S、产H2O2、产气、产黏液、硝酸盐还原酶、明胶液化试验均为阴性的乳酸菌有13株，分别是L1、L4、L7、L8、L11、L13、L15、L17、L18、L21、L24、L25和L27，因此选择这13株符合发酵剂标准的乳酸菌为研究对象，对其进行抗氧化活性的测定。

表5-53　29株乳酸菌的发酵特性

注：ND表示没有进行检测。

（二）乳酸菌发酵剂抗氧化特性分析

1.对H2O2的耐受力

H2O2是一种强氧化剂，可直接造成机体的氧化损伤或者作为羟自由基的前体物质，因此通过比较H2O2的耐受能力强弱，可以衡量菌体的抗氧化能力高低。各试验菌株在不同浓度H2O2下的存活情况如图5-100所示。

图5-100　乳酸菌对H2O2的耐受率

当H2O2质量分数为0时，菌的存活率以100%计算。如图5-100所示，13株乳酸菌对H2O2的耐受性存在着明显的差异。当H2O2质量分数为0.25%时，这13株菌均表现出比较强的H2O2耐受能力，存活率范围在82.02%～94.83%之间。当H2O2质量分数为0.50%时，13株菌存活率范围在35.87%～58.98%之间，其中存活率最高的是L11，为58.98%。当H2O2质量分数为0.75%时，13株菌存活率范围在11.84%～37.91%之间，L25对H2O2耐受能力最强，共有7株菌在H2O2的质量分数为0.75%时存活率在30%以上，分别为L4、L8、L11、L13、L15、L21和L25。当H2O2质量分数为1.0%时，菌株的生存明显受到抑制，有3株菌已经没法生长（存活率为0），对H2O2耐受性最强的L11也仅为13.56%。实验结果表明，试验菌株的生长率随着H2O2质量分数的升高而逐步下降，并且菌株间对H2O2的耐受能力表现出一定的差异性。综合以上菌株对H2O2的耐受力，选取在H2O2的质量分数为0.75%时存活率在30%以上的7株菌作为复筛菌株。

2.抗脂肪过氧化率

亚油酸不饱和体系容易受亚铁离子催化发生氧化反应生成丙二醛，丙二醛可与硫代巴比妥酸结合生成红色缩合物3，5，5-三甲基噁唑-2，4-二酮，其在532nm处有强吸收峰，其吸光度值越大则表明物质抑制脂肪氧化能力较弱。

由表5-54可知，乳酸菌各组分均具有一定抗脂肪过氧化能力，且发酵上清液组的抗脂肪过氧化能力强于菌体细胞液和胞内提取物组。在菌体浓度为1×109cfu/mL时，各菌株发酵上清液的抗脂质过氧化率范围在5%～34%之间。其中L11发酵液的抗脂肪过氧化能力最强，达到34.08%，相当于质量浓度为0.22mg/mL的VC，与其他菌株相比差异性显著（p<0.05）。菌体细胞液的抗脂肪过氧化率范围在2%～7%之间，L21的抗脂肪过氧化率最高，为7.56%，约相当于其发酵上清液的46%，与0.03 mg/mL的VC发挥同样的抗脂质过氧化作用。各菌株胞内提取物的抗脂肪过氧化率范围在2%～13%之间，其中L4的抗脂质过氧化率最高，为13.06%，约相当于其发酵上清液的60%，与0.07mg/mL的VC发挥同样的抗脂质过氧化作用。实验数据表明，乳酸菌L4和L11的抗脂肪过氧化率相对较高，且乳酸菌中具有抗脂肪过氧化能力的物质主要以胞外分泌物形式存在于发酵液中，使其发酵上清液中抗脂肪过氧化率较高。

表5-54　不同乳酸菌分离物的抗脂质过氧化率

注： 同一列右上角字母不同表示差异性显著（p<0.05）。

3.羟自由基清除率

羟自由基是一种氧化性很强的自由基，对蛋白质和脂肪具有较强的氧化作用，·OH主要是由O2-、H2O2通过Fenton反应：Fe2++H2O2→Fe3++·OH+OH-和Haber-Weiss反应+H2O2 →O2+OH-+·OH产生的。本试验通过以邻菲罗琳作为氧化还原指示剂来评价抗氧化活性乳酸菌不同组分在Fenton体系中清除羟自由基能力高低。

由表5-55可知，乳酸菌各组分对羟自由基均有一定的清除作用，发酵上清液组的羟自由基清除能力强于菌体细胞液和胞内提取物组，这与抗脂质过氧化率的结果是一致的，然而各组分对羟自由基的清除率与抗脂肪过氧化率不成正比。在菌体浓度为1×109cfu/mL时，各菌株发酵上清液对羟自由基的清除率范围在10%～45%之间。其中对羟自由基清除能力最强的是L4，为45.02%，相当于0.39 mg/mL VC，与其他菌株相比差异性显著（p<0.05）。L11对羟自由基清除能力也相对较高。菌体细胞液对羟自由基清除率范围在8%～34%之间。不同菌株对羟自由基清除率的差异较大（p<0.05），L4和L11均高于30%。胞内提取物对羟自由基清除率相对低于其他两个组分，L11的胞内提取物对羟自由基清除能力相对较强，约相当于其发酵液的83%。实验数据表明，L4和L11对羟自由基清除能力优于其他菌株，具有更好的抗氧化活性。

表5-55　不同乳酸菌分离物对羟自由基的清除率

注： 同一列右上角字母不同表示差异性显著（p<0.05）。(www.xing528.com)

4.还原力

有机物的还原电位与抗氧化能力呈正相关，还原电位越高其潜在的抗氧化活性则越强。抗氧化物质在铁氰化钾反应体系中生成的普鲁士蓝在700 nm波长处有强吸收峰，可以用普鲁士蓝生成量来反映物质的还原能力高低。

由图5-101可知，同种菌株不同组分间的还原力差距非常大（p<0.05），其中发酵上清液的还原力远高于菌体细胞液和胞内提取物，菌体细胞液的还原力略高于胞内提取物。在菌体浓度为1×109 cfu/mL时，L4和L21的发酵上清液组在700nm处的吸光度值均高于1.3，还原力比较强。菌体细胞液和胞内提取物的还原力相对发酵上清液弱很多，L21的菌体细胞液最强为0.324。L21的抗脂肪过氧化率和羟自由基清除能力虽然低于L4和L11，但其还原力均高于两者。菌株胞内提取物还原力最强的L11仅是其发酵上清液的10.82%。实验数据表明，L4和L21在700nm处的还原力相对较高，其具有较强的潜在抗氧化能力。

图5-101　不同乳酸菌分离物的还原力

综合抗脂质过氧化率、羟自由基清除率和还原力等体外抗氧化指标，发现乳酸菌L4、L11和L21不仅符合鱼类腌制品发酵剂的标准而且具有优良的抗氧化活性，可将其作为抗氧化发酵菌株应用于腌干鱼生产中。乳酸菌由于能够清除各类自由基和活性氧而拥有体外抗氧化能力和体内缓解氧化应激能力。目前国内外关于抗氧化乳酸菌的筛选已有较多的报道，但从发酵特性角度出发，筛选出既符合腌制品发酵要求又具有抗氧化活性乳酸菌的研究仍鲜见报道。据报道，植物乳杆菌对发酵樱桃茎的提取液的抗脂质过氧化率和对·DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基自由基）的清除率分别为33.20%和52.10%，证明该菌具有较高的抗氧化能力。日本有学者从鲫鱼寿司分离筛选出4株植物乳杆菌和1株肠膜明串珠菌，通过一系列的体外抗氧化试验测定，表明乳酸菌7FM10和1RM3具有优良的抗氧化活性，经过这两株菌发酵后的豆奶和果汁对超氧自由基清除能力明显提高。本研究发现不同菌株间的抗氧化活性差异明显，这可能是乳酸菌的抗氧化机制相对独立和菌株间抗氧化活性成分不同所致，与目前关于乳酸菌抗氧化活性的研究结果较为一致。

5.抗氧化发酵菌株24h生长曲线

将上述筛选到的三株抗氧化菌株进行液体培养，监测其在24h内的生长情况，结果如图5-102所示。抗氧化菌株L4、L11和L21生长趋势相似，培养8h后三株菌的OD650值（即650nm波长下）均明显升高，进入对数生长期。在培养16h后OD650值达到较高水平，进入生长稳定期。在整个生长过程中，抗氧化乳酸菌L21的生长速度略高于其他两株乳酸菌，其OD650值明显高于其他两株菌。

图5-102　抗氧化发酵菌株24h生长曲线

（三）菌种的鉴定

1.VITEK-2微生物系统鉴定结果

法国梅里埃VITEK-2微生物鉴定系统是利用多波长色谱和借助微生物信息编码技术，将纯化完毕的菌株通过真空填充到特定的鉴定卡片，让菌株进行各种生理生化代谢反应，在菌库进行聚类分析，与已知的参比菌种数据库进行对比获取待测菌株的类型。该方法与根据《伯杰氏细菌鉴定手册》进行鉴定的方法相比，具有操作简便、耗时短、可靠性高的优势的优势。该研究通过VITEK-2微生物鉴定系统对优良抗氧化菌株L4、L11和L21进行鉴定，其鉴定结果如表5-56所示。结果表明 L4可能为Pediococcus pentosaceus（戊糖片球菌），其匹配度为93%；L21为Lactobacillus paracasei（类干酪乳杆菌），其匹配度为95%，而L11的相似匹配度较低仅有68%，可能为Lactococcus lactis ssp. lactis乳酸乳球菌乳酸亚种，因此还需要借助16S rDNA分析对其做进一步鉴定。

表5-56　VITEK-2微生物系统鉴定结果

2.16S rDNA分析及系统发育树的构建

对优良抗氧化菌株L4、L11和L21的基因组进行DNA提取，用琼脂糖凝胶对16S rDNA PCR 扩增产物进行电泳，如图5-103所示，三株菌的DNA分子量均在1500bp左右，符合预期的结果。将纯的PCR产物送至华大基因公司进行测序，测序结果在NCBI的数据库和Clustalx进行BLAST同源性分析，并利用MEGA 5.0 软件采用邻位相连法（Neighborjoining）构建优良抗氧化菌株的16S rDNA基因系统发育树，结果如图5-104所示。从系统发育树的结果可以看出L4与Pediococcus pentosaceus（KF048926.1）的同源性为98%，L11与 Lactobacillus plantarum（DI352769.1）的同源性为91%，戊糖片球菌和植物乳杆菌之间的亲缘关系非常接近，其16S rRNA基因序列之间具有高度相似性，参照《常见细菌系统鉴定手册》，对L4和L11进行鼠李糖发酵产酸试验，结果发现L4呈阳性而L11呈阴性，因此可确认L4为Pediococcus pentosaceus（戊糖片球菌），L11为 Lactobacillus plantarum（植物乳杆菌）。L21与Lactobacillus casei（EU715321.1）的同源性为92%，可确认L21为Lactobacillus casei（干酪乳杆菌）。

图5-103　抗氧化菌株PCR扩增16S rDNA凝胶电泳图

注：Marker DL2000 plus从下至上依次为：5000、3000、2000、1000、750、500、250、100bp

图5-104　抗氧化乳酸菌L4、L11、L21的系统发育树

综上所述，采用发酵特性和过氧化氢耐受率为指标对分离自传统腌干鱼制品的29株乳酸菌进行了初筛实验，发现13株乳酸菌符合腌干鱼发酵要求，其中7株对H2O2（ω（H2O2）0.75%）耐受性较强，存活率在30%以上。再以体外抗氧化指标评价菌株不同组分的体外抗氧化能力，发现不同菌株间的抗氧化活性差异显著，并且发酵上清液的抗氧化活性远高于菌体细胞液和胞内提取物。最后选取了抗氧化活性较高的乳酸菌L4、L11和L21作为潜在抗氧化发酵剂，经VITEK-2微生物鉴定系统和16S rDNA分子鉴定确定L4为Pediococcus pentosaceus（戊糖片球菌，Pp ）、L11为Lactobacillus plantarum（植物乳杆菌，Lp）、L21为Lactobacillus casei（干酪乳杆菌，Lc）。这三株菌不仅符合鱼类腌制品发酵剂的标准，而且具有优良的抗氧化活性，可将其作为抗氧化发酵菌株应用于后续腌干鱼生产中。