产生物胺的微生物挖掘及特性分析

（一）产胺菌的分离纯化及生物胺检测

1.传统法腌干过程中产胺菌的分离纯化

传统法腌干蓝圆鲹4个阶段分别以L1、CLY2、CLP、CLG2表示。L1：新鲜蓝圆鲹；CLY2：腌制48h后的样品；CLP：浸泡脱盐后的样品；CLG2：干燥成品。

从传统法腌干蓝圆鲹样品中共分离筛选出不同菌落形态的产胺菌20株，其中样品L1获得5株，CLY2获得3株，CLP获得8株，CLG2获得4株，将初步筛选到的菌株在生物胺初筛培养基上纯化，均能使培养基变成蓝紫色，分别编号为A1～A5，B1～B3，C1～C8，D1～D4。腌干过程中各产胺菌的生物胺产生情况详见表5-45。

表5-45　传统法蓝圆鲹腌干样品中产胺菌的生物胺产生情况及鉴定结果

注：ND表示未检出，同一列相同字母表示差异不显著（p>0.05），同一列不同字母表示差异显著（p<0.05）。

由表5-45可知，传统法腌干蓝圆鲹中产胺菌经革兰氏染色试验，20株细菌均为革兰氏阴性菌，主要来自假单胞菌、气单胞菌、不动杆菌、沙门菌群、弧菌、巴斯德菌和根瘤菌等菌科。漂洗后的样品CLP中产胺菌的检出率最高（8株），该样品中分离得到的沙门菌群具有较强的产腐胺、尸胺、组胺和酪胺能力，嗜水气单胞菌能产腐胺、尸胺和酪胺，但产胺能力远不如沙门菌群（p<0.05）。样品CLY2中产胺菌的检出率最低（3株），且产生物胺能力最弱。原料中产胺菌主要是假单胞菌、气单胞菌、不动杆菌和沙门菌群，这些菌可以同时产生四种生物胺，其中，沙门菌群的产腐胺能力在20株菌中是最强的。样品CLG2中的产胺菌都是解藻朊酸弧菌，也都能同时产生四种生物胺，其中产尸胺和腐胺的能力较强。

传统法腌干海鲈的4个阶段分别以H1、CHY、CHP、CHG表示。H1：新鲜海鲈鱼；CHY：腌制72h后的样品；CHP：浸泡脱盐后的样品；CHG：干燥成品。

在传统法腌制加工海鲈过程中通过初步的分离筛选共获得不同菌落形态的产胺菌14株，其中H1样品获得4株，CHY获得2株，CHP获得6株，CHG获得2株。将初步筛选到的菌株在生物胺初筛培养基上纯化，均能使培养基变成蓝紫色，按照分离的时间顺序分别编号为A1～A4，B1～B2，C1～C6，D1～D2。腌干过程中各产胺菌的生物胺产生情况详见表5-46。

表5-46　传统法海鲈中产胺菌的生物胺产生情况及鉴定结果

注：ND表示未检出，同一列相同字母表示差异不显著（p>0.05），同一列不同字母表示差异显著（p<0.05）。

由表5-46可以看出，样品CHP中产胺菌的检出率最高（6株），并且大多数具有较强的产生物胺能力。而样品CHY和CHG产胺菌的检出率最低。原因是腌制过程中随着食盐的不断渗入，高浓度的食盐抑制了微生物的生长，漂洗阶段鱼肉中食盐浓度迅速下降，鱼肉暴露于空气中且肌肉水分含量较高而易于产胺菌生长。到了干燥阶段，鱼肉中水分含量的降低导致水分活度下降，抑制了细菌的生长。

通过对培养液中细菌代谢物的检测，发现所分离的各产胺菌产生物胺种类和浓度均存在很大差异。产胺菌的种类有很多，发酵鱼制品中主要有弧菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属、乳酸菌中的乳杆菌属等，这些菌种都能够产生氨基酸脱羧酶。本实验不仅分离到了假单胞菌属、葡萄球菌属和弧菌属，而且还分离出琼氏不动杆菌、麻疹孪生球菌、皮氏罗尔斯顿菌等新的产胺菌。分离的弧菌均具有较强的产尸胺和酪胺能力，但不产组胺。分离自样品CHP中的格氏乳球菌C5和C6分别具有最高的产腐胺量和产尸胺量，沃氏葡萄球菌C1的产组胺量最高。溶血葡萄球菌D1的产酪胺量最高。

2.乳酸菌辅助法腌干过程中产胺菌的分离纯化

乳酸菌法腌干蓝圆鲹的5个阶段分别以L2、SLY、SLP、SLJ、SLG表示。L2：新鲜蓝圆鲹；SLY：腌制24h后的样品；SLP：浸泡脱盐后的样品；SLJ：接种发酵17h后的样品；SLG：干燥成品。

蓝圆鲹在乳酸菌辅助腌制加工过程中通过初步的分离筛选共获得不同菌落形态的产胺菌25株，其中L2、SLY、SLP、SLJ、SLG各获得5株。将初步筛选到的菌株在生物胺初筛培养基上纯化，均能使培养基变成蓝紫色，按照分离的时间顺序分别编号为A1～A5，B1～B5，C1～C5，D1～D5，E1～E5。腌干过程中各产胺菌的生物胺产生情况详见表5-47。

表5-47　乳酸菌法蓝圆鲹中产胺菌生物胺产生情况及鉴定结果

续上表

注：ND表示未检出，同一列相同字母表示差异不显著（p>0.05），同一列不同字母表示差异显著（p<0.05）。

由表5-47可以看出，蓝圆鲹在乳酸菌辅助腌制加工过程中的产胺菌全部为革兰氏阴性菌，随着加工过程的进行，产胺菌的微生物菌相开始变得单一，主要以弧菌、气单胞菌、鞘氨醇单胞菌、放射根瘤菌为主，而且其产生物胺能力明显降低（p<0.05），说明加入的乳酸菌发酵剂具有抑制部分革兰氏阴性菌的作用。(www.xing528.com)

乳酸菌法腌干海鲈5个阶段分别以H2、SHY、SHP、SHJ、SHG表示。H2：新鲜海鲈鱼；SHY：腌制24h后的样品；SHP：浸泡脱盐后的样品；SHJ：接种发酵17h后的样品；SHG：干燥成品。

海鲈在乳酸菌辅助腌制加工过程中通过初步的分离筛选共获得不同菌落形态的产胺菌18株，其中样品H2获得5株，SHY获得2株，SHP获得4株，SHJ获得4株，SHG获得3株。将初步筛选到的菌株在生物胺初筛培养基上纯化，均能使培养基变成蓝紫色，按照分离的时间顺序分别编号为A1～A5，B1～B2，C1～C4，D1～D4，E1～E3。腌干过程中各产胺菌的生物胺产生情况详见表5-48。

表5-48　乳酸菌法海鲈中产胺菌生物胺产生情况及鉴定结果

续上表

注：ND表示未检出，同一列相同字母表示差异不显著（p>0.05），同一列不同字母表示差异显著（p<0.05）。

由表5-48可以看出，样品H2中产胺菌的检出率最高（5株），但是产生物胺能力并不显著（p>0.05），样品SHY中筛选到的产胺菌主要是阴沟肠杆菌，并且此菌可以同时产生四种生物胺，其中产腐胺能力最显著（p<0.05）。在样品SHP中分离到的弗氏柠檬酸杆菌和嗜水气单胞菌也具有同时产生四种生物胺的能力，且产酪胺和组胺能力较强（p<0.05），组胺和酪胺是生物胺中毒性最强的物质，因此，在加工过程中，我们一定要严格控制此环节的卫生状况，防止细菌污染。

（二）腌制条件对产胺菌的生长和产生物胺能力的影响

1.温度对产胺菌生长和产生物胺量的影响

通常情况下，25～35℃的温度范围对产胺菌的生长最有利，且在该温度范围内产胺量也最大；温度低于4℃时，产胺菌的生长和产胺能力均会受到抑制。这与本研究的结论一致，由图5-80可以看出，20～35℃温度范围最适合四株产胺菌的生长，在30℃下，四株产胺菌的吸光度值（OD值）均达到最大且均有最大的产生物胺量。低温对产胺菌的生长和产胺量均有明显的抑制作用，温度低至4℃时，产胺菌株仍能生长，但产胺量明显减少。当温度低至0℃时，四种产胺菌株的产生物胺能力明显被抑制，几乎不产生物胺。但在20～30℃范围内，产胺菌的生长和产胺量均随着温度的上升而增加，之后，随温度的上升而减少。由此可见，30℃对产胺菌的生长最有利，同时，在该温度下，四株产胺菌均有最大产胺量。因此，尽量避免将产品暴露在30℃左右的环境中；另外，低温贮藏也可以抑制生物胺的产生。

图5-80　温度对菌株生长和产生物胺量的影响

注：C1菌株的生物胺含量指组胺含量，C6菌株的生物胺含量指腐胺，C5指尸胺，D1指酪胺。下同。

2.pH对产胺菌生长和产生物胺量的影响

由图5-81可以看出，在pH 6～8范围内，四株产胺菌均有较大吸光度值，且在pH=6时吸光度值均达到最大，同时，沃氏葡萄球菌在pH=6时也达到最大产组胺量，但是，其他三株产胺菌的产生物胺含量受pH变化的影响很小。在pH 4～5范围内，吸光度值基本没有变化，说明低pH可以抑制产胺菌的生长。总的来说，pH变化对产胺菌生长和产组胺能力有一定的影响，但是对其产腐胺、尸胺和酪胺能力的影响并不明显。

图5-81　pH对菌株生长和产生物胺量的影响

3.食盐浓度对产胺菌生长和产生物胺量的影响

由图5-82可以看出，食盐质量浓度<50g/L，产胺菌均能正常生长，但随食盐质量浓度增大，对产胺菌的抑制作用也越明显。在100g/L食盐质量浓度下，沃氏葡萄球菌虽然能缓慢生长，但其产组胺能力明显被抑制，几乎不产组胺。溶血葡萄球菌耐盐性最强，在200g/L的食盐质量浓度下仍能生长，但产酪胺量为0，同时，在该食盐浓度下腐胺和尸胺含量也为0。由以上结果可知，100～200g/L的食盐质量浓度可以抑制产胺菌的生长，100g/L食盐质量浓度可以抑制组胺的产生，但是，200g/L的食盐质量浓度才可以抑制腐胺、尸胺和酪胺的形成。有报道称，当培养基中的食盐百分比从0增加到6%时，保加利亚乳杆菌的数量和产生物胺能力大大降低。而本研究中得出100g/L以上的食盐质量浓度才可以抑制产胺菌，可能是由于这些产胺菌本身来源于传统腌制海鲈，自身的耐盐性比较强。

图5-82　食盐浓度对菌株生长和产生物胺量的影响

总之，腌干鱼制品中生物胺的产生与微生物有着密不可分的联系，假单胞菌、气单胞菌，弧菌、肠杆菌和葡萄球菌是腌干鱼加工过程中的优势产胺菌，沙门菌群、嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、格氏乳球菌、沃氏葡萄球菌、溶血葡萄球菌、阴沟肠杆菌和弗氏柠檬酸杆菌均具有较强的产生物胺能力，在腌干鱼的加工和贮藏过程中，要严格防范这些细菌的滋生，提高产品的安全性。