使用酶法去除腌干鱼中亚硝基化合物的技术

（一）影响亚硝酸盐还原酶（NiRs）降解腌干鱼中亚硝酸盐的主要因子

1.NiRs浓度对腌干鱼中亚硝酸盐降解率的影响

在腌干鱼加工过程中，NiRs浓度增加后，NiRs活性增大，亚硝酸盐的含量减少，亚硝酸盐降解率增大，如图5-46所示。根据实验结果，NiRs能够有效降低腌干鱼中亚硝酸盐的含量，在其质量浓度4～5g/L条件下亚硝酸盐降解量最大。对照组不加酶的亚硝酸盐含量为3.688μg/g，在NiRs质量浓度是4g/L时，腌干鱼中亚硝酸盐含量降低为3.038μg/g，降解率达到17.628%。

图5-46　不同浓度NiRs对亚硝酸盐降解率的影响

2.不同温度条件下NiRs对腌干鱼中亚硝酸盐残留量的影响

温度对于酶活性的影响很大，根据NiRs的温度生长条件，设置因素梯度为27～40℃。将加入等量酶液的腌制鱼放入不同温度的培养箱中，亚硝酸盐降解率测定结果如图5-47所示。NiRs对腌干鱼中亚硝酸盐降解率的影响呈正态分布变化，不加酶对照组的亚硝酸盐含量为4.329μg/g，温度较低时酶活性受到抑制。随着温度升高，NiRs酶活性逐渐增大，亚硝酸盐降解率逐渐增加。在35℃条件下亚硝酸盐降解率达到最大，此时的亚硝酸盐含量为3.077μg/g，亚硝酸盐降解率达到28.912%。超过35℃后，酶活性逐渐呈下降趋势，亚硝酸盐降解率也逐渐减小。这是由于温度较高时导致部分酶活性丧失。这说明温度对于NiRs降解亚硝酸盐的效果影响显著。由此得出，亚硝酸盐降解量最大的温度在35℃左右，这与NiRs的最适温度的酶学性质研究结果相同。

图5-47　不同反应温度NiRs对亚硝酸盐降解率的影响

3.不同反应时间下NiRs对腌干鱼中亚硝酸盐残留量的影响

在其他条件相同的前提下，控制腌干鱼加工过程中加入NiRs的反应时间，测量结果如图5-48所示。不加酶对照组的亚硝酸盐含量为4.371μg/g。随着时间的增加，NiRs的降解效果逐渐明显，亚硝酸盐降解率逐渐增大。在4h时亚硝酸盐降解率达到最大，此条件下测得的亚硝酸盐含量为3.180μg/g，降解率达到27.241%。超过4h后，亚硝酸盐降解率有明显降低趋势，可能由于温暖的条件下长时间放置腌干鱼，鱼体蛋白质分解又产生亚硝酸盐。因此测得的亚硝酸盐降解率下降。超过10h后，腌干鱼鱼肉有明显的刺鼻气味，超过12h以后，虽然亚硝酸盐降解率上升，但有可能是腌干鱼体内细菌产酸对亚硝酸盐进行了酸降解。因此，控制NiRs反应时间4h为最佳。（二）响应面法优化NiRs在腌干鱼工艺中的添加条件

图5-48　不同反应时间NiRs对亚硝酸盐降解率的影响

根据Design-expert的中心组合实验设计原理，综合酶浓度、温度和时间单因素实验结果，以亚硝酸盐降解率为响应值，在单因素实验基础上采用三因素三水平的响应面分析方法。根据软件设计的实验组方案进行实验后，得到NiRs降解率结果如表5-11所示。

表5-11　响应面设计方案与实验结果

注：A因素的三个水平分别为3g/L、4g/L和5g/L；B因素的三个水平分别为33℃、35℃和37℃；C因素的三个水平分别为2h、4h和6h。

根据17组实验结果，用Design-expert软件进行回归拟合分析，得出三种因素变量和亚硝酸盐降解率的关系可以用函数表示：

Y=31.09+2.72A-3.19B+2.91C+1.73AB-1.02AC+1.06BC-8.14A2-4.44B2-3.73C2

为了说明回归方程的有效性，对回归模型进行方差分析，结果如表5-12所示。回归方程R2=0.987，方程的F=61.14>F0.01（9.5）= 37.905，p=0.0001<0.01，说明回归模型拟合性极显著。所以说这个实验模型能可靠表示出酶浓度、酶作用温度和酶作用时间之间的交互关系。方程失拟项为p=0.5983>0.05，故失拟项不显著。说明此模型拟合度好，实验误差较小。因此可以用该回归方程对实验结果进行分析。根据交互项方差分析结果来看，酶浓度与温度的交互作用AB项的F值为9.52，p=0.0177<0.05，说明酶浓度与温度交互作用对亚硝酸盐降解量的影响显著性最高。

表5-12　回归方程方差分析

根据回归方程方差分析结果，用Design-expert软件作等高线和3D等高图，得到拟合响应曲面的形状，如图5-49～图5-51所示。从图中可直观看出NiRs的酶浓度、温度、时间交互作用对亚硝酸盐降解率的影响。由图5-49可知，酶浓度曲线变化比反应温度曲线变化密集，说明酶浓度变化比反应温度对亚硝酸盐降解率的影响略大。由图5-50可知，酶浓度曲线变化比反应时间曲线密集，说明亚硝酸盐降解率对酶浓度变化比对反应时间略敏感。由图5-51可知，酶的反应温度曲线变化比反应时间曲线变化密集，说明酶的反应温度变化比反应时间变化对亚硝酸盐降解率的影响更大。

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图5-49　酶浓度-温度的交互影响

图5-50　酶浓度-时间的交互影响

图5-51　温度-时间的交互影响

在Design-expert软件的结论中，使NiRs对亚硝酸盐降解量达到最佳的条件是：酶浓度4.1g/L、温度34.4℃、时间4.7h，亚硝酸盐降解率可达到32.799%。根据此条件重复实验，得到亚硝酸盐降解率为32.751%。实验结果与预测结果基本一致。根据响应面所得实验结果可知，在腌干鱼加工过程中加入NiRs，其酶浓度、酶反应温度、酶反应时间均对亚硝酸盐的最终降解率有极显著的影响，并且酶浓度与酶反应温度的交互作用较明显，而酶浓度与酶反应时间、酶反应时间与酶反应温度之间的交互作用对亚硝酸盐降解率的影响不是很明显。三种因素最优的条件组合为酶浓度4.1g/L、温度34.4℃、时间4.7h。

据报道，NiRs在散装人参萝卜、雪里蕻、塑料包装腊肠、腊肉中的应用已有初步研究，结果显示在加酶12h后这几种食品的亚硝酸盐均可降低到国家规定的食品安全标准以下。NiRs在猪肉小香肠、鸡肉香肠、伯尔尼舌肠、乡村烤香肠、法兰克福小香肠以及白香肠等中的应用研究结果显示，几组香肠的亚硝酸盐降解率最高的是乡村烤香肠，达到93.45%，亚硝酸盐降解率最低的是猪肉小香肠，为72.71%。本研究证明在腌干鱼类加工过程中加入NiRs同样可以降解亚硝酸盐。腌干鱼类中的亚硝酸盐降解率低于香肠，原因可能是香肠中的亚硝酸盐含量本身较高，因此测出的亚硝酸盐降解率更高，而腌干鱼制品中的亚硝酸盐含量不高。香肠是肉糜，添加NiRs可以均匀作用，而腌干鱼鱼体各部分不同，不易均匀添加。除此之外，香肠原料是畜牧产品，与水产品差异较大。本实验中由于原料的限制，加入酶液的浓度较低，可通过进一步实验提高酶浓度增加亚硝酸盐的降解率。

（三）NiRs对腌干鱼品质的影响

1.NiRs对腌干鱼色差的影响

加入不同浓度的NiRs，与不加酶的对照组对比，记录不同实验组的色差变化。结果表5-13所示。方差分析见表5-14。L*表示黑白，+表示偏白，-表示偏暗。a*表示红绿，+表示偏红，-表示偏绿。b*表示黄蓝，+表示偏黄，-表示偏蓝。空白对照组色差指标：L*67.37、a*1.065、b*18.62。实验组平均值：L*为66.575、a*为0.855、b*为17.887。实验组与对照组相比，L*、a*、b*值均略有减小。平均偏差：L为*-0.795、a*为-0.21、b*为-0.733。

单纯的L、a、b是绝对值，用这三个数值在一个三维立体图中，可以精确表示出一个颜色点，见图5-52。根据总色差计算公式ΔE=（ΔEa2+ΔEb2+ΔEL2）/2可以得出，实验组平均色差ΔE为0.6067。当总色差ΔE在0～0.25时表示非常小或没有色差。ΔE在0.25～0.5时表示色差微小，可完全接受。ΔE在0.5～1.0时表示色差微小到中等，大部分应用可接受，长期专业训练的人可发现。ΔE在1.0～2.0时为色差中等，高倍率输出时可见，特定应用中可接受。ΔE在2.0～4.0时表示色差有一定差距。ΔE>4.0时表示色差非常大，大部分肉眼可见明显。方差分析中L值的F值为1.209，p值0.406。a值的F值为3.432，p值为0.083。b值的F值为3.799，p值为0.067。所以pL、pa、pb均>0.05，在0.05水平上变化均不显著。

由于实验组与对照组相比，色差属于微小范围，所以可以认为，鱼类腌制加工过程中加入NiRs后，对腌干鱼制品的色差无明显影响。

表5-13　NiRs对腌干鱼色差的影响

表5-14　腌干鱼色差方差分析表

续上表

图5-52　NiRs对腌干鱼色差影响3D图

2.感官评定结果

在鱼腌制过程中加入NiRs后进行感官评价，并与传统腌制方法加工的腌干鱼类做对比，结果如表5-15所示。鱼腌制过程中加入NiRs后，外观、嚼劲、口感和总分与传统加工方法相比差异显著，p<0.05，并且比传统腌制法得到的腌干鱼分值高。仅有气味一项两种加工方法差异不显著，p>0.05。说明在鱼腌制过程中，加入NiRs可以促进腌干鱼类中风味物质的形成，在感官上对传统加工的腌干鱼有一定提升，能改善腌干鱼制品的风味。

表5-15　感官评定结果