技术分享：微生物法有效去除腌干鱼中亚硝基化合物

将三种乳酸菌菌株悬液（植物乳杆菌、戊糖片球菌、肠膜明串珠菌）以及植物乳杆菌与戊糖片球菌混悬液、植物乳杆菌与肠膜明串珠菌混悬液分别按下面所述工艺接入腌制鱼中发酵，待烘干后（水分含量约为35%），对腌干鱼中的亚硝酸盐含量进行测定，研究不同条件对乳酸菌降低腌干鱼类中亚硝酸盐的影响。

腌干鱼类加工工艺流程为：原料鱼→清洗→沥干→腌制→清洗→接种乳酸菌→发酵→干燥→成品。

菌悬液的制备方法为：将菌株植物乳杆菌、戊糖片球菌、肠膜明串珠菌接种于MRS肉汤中活化三代后，接种于MRS肉汤培养基中，37℃培养18～24h后，于4℃、10000r/min离心3min，用无菌生理盐水重悬后，再次离心，重复操作三次，采用活菌计数法，对菌体浓度进行计数，并稀释到108cfu/mL，于4℃冰箱保存备用。

（一）接种单菌与接种混菌的降解效果比较

分别对上述接种样品中的亚硝酸盐含量进行测定，以未接种的腌干鱼制品作对照，结果见图5-42。

图5-42　接种不同乳酸菌对腌干鱼类中亚硝酸盐含量的影响

注：柱形图上方不同字母表示差异显著，p<0.05。

由图5-42可看出，接种单菌和双菌对腌干鱼中的亚硝酸盐含量的影响有所不同。但是，接种乳酸菌较未接种的腌干鱼亚硝酸盐含量都有所降低。从单菌来看，与肠膜明串珠菌相比，接种植物乳杆菌、戊糖片球菌的腌干鱼制品的亚硝酸盐降解效果较好。从双菌来看，肠膜明串珠菌与戊糖片球菌的混合菌对亚硝酸盐的降解效果不明显，而植物乳杆菌与戊糖片球菌的混合菌降解效果显著（p<0.05），这可能是由于不同菌株之间的相互作用所致。此外，前面章节的研究表明，接种混合菌发酵可以促进腌干鱼制品中风味物质的形成，使腌干鱼制品的风味更加浓郁。故选择植物乳杆菌与戊糖片球菌的混合菌作后续试验。

（二）发酵温度对降解效果的影响

将接种乳酸菌腌干鱼制品在不同温度下发酵，结果见图5-43。

图5-43　不同发酵温度对腌干鱼制品中亚硝酸盐含量及降解率的影响

由图5-43可以看出，温度太低不利于乳酸菌的生长，腌干鱼制品中亚硝酸盐含量较高。当温度上升到乳酸菌群合适的温度时，乳酸菌群大量生长，大量产酸，在抑制了腐败菌的同时增强了降解作用。当温度继续上升后，乳酸菌的生长又受到一定程度抑制，产酸量又降低，而且有可能利于腐败菌的生长，因此腌干鱼制品中亚硝酸盐含量较高。随着发酵温度的升高，鱼体中的微生物生长繁殖加快，硝酸盐还原菌和亚硝酸还原酶的活性较强，加快了腌干鱼制品中含氮物质向硝酸盐转化、硝酸盐向亚硝酸盐转化和蛋白质分解的速度，使得亚硝酸盐在鱼体中积累速度加快，其含量增高。由图中可以看出，在35℃时亚硝酸盐含量最低，故选择35℃进行下一步试验。

（三）发酵时间对降解效果的影响

对接种乳酸菌的腌干鱼制品的发酵时间进行了研究，试验结果见图5-44。

图5-44　不同发酵时间对腌干鱼制品中亚硝酸盐含量及降解率的影响

由图5-44可以看出，随着发酵时间的延长，腌干鱼制品中的亚硝酸盐含量逐渐降低。发酵20h后，腌干鱼制品中的亚硝酸盐含量无明显变化。其原因可能是：一方面，随着发酵时间的延长，乳酸菌降解亚硝酸盐的活性增强；另一方面，乳酸菌的繁殖抑制了亚硝酸盐还原菌的生长，使腌干鱼制品中硝酸盐向亚硝酸盐转化和蛋白质分解的速度减慢，从而降低了亚硝酸盐在鱼体中的积累。由图中可以看出，发酵20h后趋于平稳但略有上升，故选择20h进行下一步试验。

（四）接种菌株的比例对降解效果的影响

接种菌株的比例对降解效果的影响如图5-45。(www.xing528.com)

图5-45　接种菌株的比例对腌干鱼制品中亚硝酸盐含量及降解率的影响

由图5-45可见，接种混合菌种的产品的亚硝酸盐含量明显降低，亚硝酸盐的降解率较高。不同的接种比例产品的亚硝酸盐含量有较大差别。当植物乳杆菌和戊糖片球菌的比例为2∶1时，对亚硝酸盐的降解效果明显。可能是该试验组的产酸速率最快，对其他腐败菌的抑制作用明显，且在此比例下，亚硝酸盐还原酶的活性较高。通过亚硝酸盐的结果可以看出，该试验组的综合得分较其他实验组为高。故选择此比例进行下一步的试验。

（五）正交试验优化发酵工艺

选择发酵温度、发酵时间、接种菌株的比例三个因素进行正交试验，测定发酵后腌干鱼产品的亚硝酸盐含量，以外观、滋味、气味、口感四方面进行感官评价，确定最佳工艺参数。正交试验结果见表5-8。

表5-8　正交试验结果

续上表

注：A因素的三个水平分别为30℃、35℃和40℃；B因素的三个水平分别为15h、20h和25h；C因素的三个水平分别为1∶1、2∶1和1∶2。

由表5-8可以看出，2号处理所得样品亚硝酸盐含量最低，为0.40mg/kg，感官评分为83.65分，8号处理样品亚硝酸盐含量最高，感官评分为78.86分。发酵温度、发酵时间、接种比例三个因素的极值R分别为0.180、0.533、0.742，因此各因素对试验结果的影响大小顺序为：接种菌株的比例>发酵时间>发酵温度。试验获得最佳工艺水平组合为C2B2A1，即发酵温度为30℃、接种植物乳杆菌和戊糖片球菌接种比例为2∶1、发酵时间20 h。

比较各因素方差大小，结果如表5-9所示。

表5-9　方差分析

由表5-9可以看出，对亚硝酸盐含量有显著影响的因素为接种菌株的比例，而温度对试验结果影响最小。这可能是因为所选实验温度都比较适合微生物的生长。但根据单因素试验，较高的温度虽然能促进乳酸菌生长，但同时也有利于激活蛋白酶及一些有害微生物的生长，使鱼肉腐败糜烂，促使鱼肉中亚硝酸盐含量增加，从而导致温度对亚硝酸盐的影响不显著。

（六）最优工艺验证试验

根据确定的最佳工艺条件进行验证试验，同时以传统方法加工的腌干鱼制品作对照，测定样品中亚硝酸盐含量，并作感官评价，来验证正交试验结果，具体结果见表5-10。

表5-10　验证试验的结果

从表中可以看出，传统方法加工的腌干鱼类亚硝酸盐含量为1.73mg/kg，感官评分为72.65分；乳酸菌法加工的腌干鱼类亚硝酸盐含量为0.58mg/kg，感官评分为87.86分。相对传统方法，乳酸菌法对腌干鱼制品中亚硝酸盐的降解率达66.5%，基本与正交试验结果吻合，且两项指标均优于传统方法加工的腌干鱼。而且经过验证试验，发现乳酸菌法加工腌干鱼类的干腌风味浓郁，咸度适宜，鲜味足，鱼体完整，鱼肉组织结实致密，有光泽。