挖掘和特性分析降解亚硝酸盐及亚硝基化合物的功能微生物

乳酸菌是腌制食品自然发酵中的常见菌种之一，许多研究表明乳酸菌具有降解亚硝酸盐的作用。同时，乳酸菌发酵还能赋予食品芳香的风味和良好的口感，并且可以降低产品的pH，从而抑制有害菌的生长。

（一）具有降解亚硝酸盐和亚硝基化合物特性的微生物菌株筛选

1.菌株的分离

乳酸菌大多分布于培养基的中部或底层，呈白色或米黄色，不透明或半透明。菌落呈圆形或针尖状，表面湿润光滑、边缘整齐、形态微小。根据以上特征，通过菌落形态观察，从腌制大黄鱼中共分离出64株具有上述特征的菌株，将其认定为乳酸菌疑似菌株。

将分离出的64株乳酸菌疑似菌株进行革兰氏染色，并于100倍油镜下进行观察。其中有26株为革兰氏阳性杆菌，12株为革兰氏阳性球菌，18株为革兰氏阴性杆菌，8株为革兰氏阴性球菌。

2.降解亚硝酸盐菌株的筛选

将38株革兰氏阳性菌接入含亚硝酸盐的改良MRS培养基中，培养一定时间后，检测培养基中的亚硝酸钠含量，结果列于表5-3。由表5-3看出，菌株j1、j2、j3、j4、j5、j6、b1、b2、b3、b4、b5、b6在接种培养72h后，培养基中亚硝酸盐含量都有不同程度的降低，而对照组CK培养液中亚硝酸盐降解量很小。说明这12株菌具有降解亚硝酸盐的能力，并且不同菌株在降解亚硝酸盐的能力上有差异。其中菌株b2、j2、j5对亚硝酸盐的降解量均明显大于其他菌株。在72h以后，b2菌株对亚硝酸盐的降解率为96.2%，j5菌株对亚硝酸盐的降解率为91.2%，j2对亚硝酸盐的降解率为85.6%。

表5-3　不同菌株降解亚硝酸盐能力

为了比较各菌株之间对亚硝酸盐降解能力的差异性，对表5-3中的数据进行了方差分析，结果如表5-4所示。

表5-4　方差分析

查表获得：F0.05（12，60）= 1.92，F0.01（12，60）= 2.59，F0.05（5，60）= 2.37，F0.01（5，60）= 3.34，F（A）= 14.20＞F0.01，说明A因子（菌株）之间差异显著；F（B）= 78.25>F0.01，说明B因子（时间）之间差异显著。因此，不同菌株在各时间段对亚硝酸盐的降解量差异显著。

由表5-3还可看出，各菌株随着培养时间的延长，在各时间段对亚硝酸盐的降解效率有所不同，对其各时间段对亚硝酸盐的降解率作图，结果如图5-32所示。

图5-32　各菌株亚硝酸盐降解率

由图5-32可看出，菌株b2、j2和j5在各时间段，对亚硝酸盐的降解率在36h内始终大于其他菌株，降解曲线的峰值最高，说明在此过程中其对亚硝酸盐的降解速率最大。b2、j2和j5菌株对亚硝酸盐的降解时间比其他菌株更短，在36h内对亚硝酸盐的降解率较其他菌株也更加明显。

3.菌株的形态及生化特征

经过革兰氏染色后于100倍油镜下观察，其中b2、j2、j5三菌株的形态见图5-33。

图5-33　光学显微镜下菌株的形态

菌株b2、j2和j5的生化特征及糖发酵实验结果见表5-5和表5-6。

表5-5　菌株的形态及生化特征

注：“+”表示实验结果为阳性，“-”表示实验结果为阴性，下同。

表5-6　菌株的糖发酵试验

通常认为MRS培养基上培养出来的革兰氏染色为阳性，过氧化氢酶试验为阴性，并且利用葡萄糖产酸的细菌可以初步判断为乳酸菌。根据表中菌株的形态学特征、理化性状及糖发酵试验，以及《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》和《伯杰细菌鉴定手册》报道菌种的相应生物学特性，初步判断j2和b5属于乳杆菌属，j5属于片球菌属。而且j2很可能是肠膜明串珠菌，j5很可能是戊糖片球菌，b2很可能是植物乳杆菌。

4.16S rDNA鉴定

（1）PCR扩增结果

用1.0%的琼脂糖凝胶对16S rDNA扩增产物做电泳检测EB染色后，在大约1500 bp处出现荧光条带，如图5-34所示。

图5-34　乳酸菌16S rDNA扩增结果

（2）16S rDNA测序结果

PCR产物测序结果表明，b2、j2、j5的测序片段长分别为1436bp、1456bp、1440bp，具有典型的16S rDNA的特征。

登陆GenBank，通过将所测序列的BLAST与NCBI数据库比对发现，菌株b2与植物乳杆菌在16S rDNA序列上相似度较高，菌株j2与肠膜明串珠菌在16S rDNA序列上相似度较高，菌株j5与戊糖片球菌在16S rDNA序列上相似度较高。这与生理生化特征鉴定结果基本一致。为了进一步确定该菌的种别，进行了系统进化分析，画出了发育树来进行断定。

（3）系统进化分析结果

16S rDNA经序列测定后，与Genbank中的序列进行比对，通过相似度选择，选出具有代表性的菌株。进化树比对使用距离法，树中菌株间的进化关系以水平距离长短来表示。菌株的进化树如图5-35所示。(www.xing528.com)

图5-35　基于乳酸菌16S rDNA序列和Neighbor-joining法构建系统发育树

从Genbank菌株中选择亲缘关系较远的菌株构建系统发育树，从而分析菌株间的亲缘关系。分析结果表明，菌株b2与FJ386491.1（Lactobacillus plantarum AF1，植物乳杆菌）亲缘关系最近，菌株j2与AB023246.1（Leuconostoc mesenteroides BW2，肠膜明串珠菌）亲缘关系最近，菌株j5与AF515227.1（Pediococcus pentosaceus RO95，戊糖片球菌）亲缘关系最近，因此断定菌株b2为植物乳杆菌（Lp），j2为肠膜明串珠菌（Lm），j5为戊糖片球菌（Pp），并且菌株b2很有可能与Lactobacillus plantarum AF1同亚种，j2很有可能与Leuconostoc mesenteroides BW2同亚种，菌株j5很有可能与Pediococcus pentosaceus RO95同亚种。

（二）降解亚硝酸盐乳酸菌的生物学特性分析

1.乳酸菌生长曲线测定

乳酸菌的生长曲线如图5-36所示。

图5-36　菌株的生长曲线

从图5-36看出，这3株乳酸菌的生长速度以戊糖片球菌（Pp）的生长速度最快，说明此菌生长为良好，该菌株在最初培养的4～20h内，其生长就快于其他2个菌株，通过以后的吸光度值（OD值）测定观察，其生长速度随着时间的增加与其他2个菌株的差异逐渐增大。肠膜明串珠菌（Lm）和戊糖片球菌在初期的20h内，生长曲线基本一致，在20h后才出现差异，后又基本一致。

生长曲线的测定有利于观察菌株在生长过程中菌体密度的变化，进而掌握菌体的活力变化，以确定菌体的最佳收获时间。菌体活力强，单位体积菌数多的培养时间为收获的最佳时间，也就是对数生长末期、稳定生长前期。由图5-36可以看出，随着培养时间的延长，植物乳杆菌（Lp）、戊糖片球菌和肠膜明串珠菌的菌体密度也都随之逐渐增大。在培养4h后到达对数生长期，培养16h后，到达稳定生长期。此时菌体密度达到最大值，是菌体的最佳收获时期。

2.乳酸菌对温度的耐受性

乳酸菌的耐温性曲线如图5-37所示。

图5-37　菌株耐温性曲线

由图5-37可看出，植物乳杆菌、戊糖片球菌和肠膜明串珠菌在15～45℃范围内均可生长。当培养温度为35℃时，菌体生长最为旺盛。当培养温度为15℃时，这3株乳酸菌都有微弱的生长；随着温度的升高，各菌株的生长速率也随之加快，在35℃左右时达到最大；但高于此温度之后，生长曲线开始下滑，这可能是在较高温度下，乳酸菌迅速达到稳定期，不利于生物量的积累；高于50℃时，3株乳酸菌的生长都受到明显抑制，但戊糖片球菌对温度的耐受性显著强于另外两株菌，在50℃时，其仍有一定的生长能力。总体来说，这3株乳酸菌的生长温度范围较广，适宜生长温度范围为20～40℃，其中戊糖片球菌对温度的耐受性较强，在45℃时生长状况良好。

3.乳酸菌对NaCl的耐受性

乳酸菌的耐盐曲线如图5-38所示。

图5-38　耐盐曲线

由图5-38可以看出，这3株乳酸菌均可以在盐质量分数为0～10%的范围内生长，但植物乳杆菌、戊糖片球菌的生长情况明显好于肠膜明串珠菌，说明植物乳杆菌、戊糖片球菌对NaCl的耐盐性较强，当NaCl的质量分数在5%～10%时，其生长能力未受到太大的影响；但当NaCl质量分数达到15%时，生长受到一定程度的影响；肠膜明串珠菌的耐受性相对较弱，当NaCl质量分数在5%～15%内其生长呈直线下降；当NaCl质量分数达到或超过20%时，这3株乳酸菌基本无生长迹象。

4.拮抗性试验分析

表5-7　菌株间拮抗性试验

从表5-7可以看出植物乳杆菌与戊糖片球菌、植物乳杆菌与肠膜明串珠菌两两之间无拮抗作用，可以用作混合菌种发酵实验。

（三）不同培养条件下乳酸菌对亚硝酸盐降解效果的影响

1.不同培养温度对乳酸菌降解亚硝酸盐的影响

图5-39　温度对乳酸菌降解亚硝酸盐的影响

由图5-39可以看出，在不同处理温度下，3株乳酸菌对亚硝酸盐都有不同程度的降解，在30℃和35℃时，对亚硝酸盐的降解量显著高于15℃、20℃和45℃时的亚硝酸盐降解量。随着培养时间的延长，亚硝酸盐的降解量呈增加趋势。不论是16h还是24h，均在35℃下出现最大降解量。说明温度是乳酸菌降解亚硝酸盐的一个重要的影响因素。

2.不同起始pH对乳酸菌降解亚硝酸盐的影响

图5-40　pH对乳酸菌降解亚硝酸盐的影响

由图5-40可以看出，在不同的pH条件下，乳酸菌对亚硝酸盐的降解量受培养基pH的影响很大，降解的最适pH为5.5，活性范围为4.5～6.5。各菌株在pH<4.5时对亚硝酸盐的降解效果不明显，在pH>4.5时对亚硝酸钠的降解量显著增加。这可能是分离到的乳酸菌菌株对亚硝酸钠的降解以酶降解为主，酸降解发挥着次要的作用。

3.不同NaCl质量分数对降解亚硝酸盐的影响

图5-41　不同NaCl质量分数对乳酸菌降解亚硝酸盐的影响

由图5-41可以看出，NaCl的含量对3株乳酸菌的生长均有不同程度的影响，低质量分数的NaCl（1%～3%）对亚硝酸盐的降解影响不大，这说明从腌制鱼类中分离的乳酸菌对亚硝酸盐的降解作用在低浓度食盐环境下影响不大，具有一定的耐盐能力，具备应用于腌制食品的潜力。而当NaCl质量分数达到一定程度（10%以上），对乳酸菌降解亚硝酸盐有明显的抑制作用。这可能是高浓度的NaCl抑制了菌的生长从而影响乳酸菌对亚硝酸盐的降解，也可能是影响了培养液中乳酸菌亚硝酸盐还原酶的生成量或抑制乳酸菌亚硝酸盐还原酶的活性。