传统法与生物法腌干工艺中组织蛋白酶、游离氨基酸与滋味的关系探究

（一）样品制备方法

传统法（HS）腌干鱼工艺：冰鲜蓝圆鲹去内脏后洗净，放入腌渍池中，一层鱼一层盐（盐/鱼=20%），后灌入饱和食盐水至淹没全部鱼体，4℃下腌制36h，取出并用清水浸泡3～4 h（0.5～1 h换水一次），浸泡脱盐结束后置于晒网上晾干水分，再移入28℃±2℃热泵干燥机中烘干至鱼体水分含量约为30%，包装即为成品。

低盐乳酸菌法（LAS）腌干鱼工艺：冰鲜蓝圆鲹去内脏后洗净，放入腌渍池中，一层鱼一层盐（盐/鱼=10%），后灌入饱和食盐水至淹没全部鱼体，4℃腌制24 h，取出并用清水浸泡3～4h（0.5～1 h换水一次），浸泡脱盐结束后置于晒网上晾干水分，接种混合乳酸菌液（Lp∶Pp∶Lm∶La∶Lb=4∶4∶2∶3∶4），菌液浓度109 cfu/mL，接种量为10%（V/W），接种完成后置于热泵干燥机中调节温度在26℃±1℃，恒温发酵17 h，然后调节温度至28℃±2℃烘干至鱼体水分含量为30 %，包装即为成品。

两种腌制加工工艺在加工过程中分五个阶段取样：样品A（鲜蓝圆鲹）、样品B（腌制后）、样品C（脱盐后）、样品D（烘干中期）、样品E（烘干后成品）。每个取样阶段均取样5～8条样品鱼，去除可见脂肪及鱼皮，用绞肉机将样品鱼肉均匀绞碎，密封保存于-30℃冰箱中。

（二）蓝圆鲹腌干工艺加工过程中内源性蛋白酶类活性变化分析

如图4-40所示，组织蛋白酶B、L活性相比鲜鱼中酶的活性在传统法（HS）成品中和低盐乳酸菌法（LAS）成品中分别提升了46.91%、113.11%和 27.16%、100%；HS法中组织蛋白酶H活性下降了7.37%，LAS法中组织蛋白酶H活性提升了10.53%。三种组织蛋白酶B、L、H在传统腌干工艺蓝圆鲹和低盐乳酸菌加工过程中变化趋势不相同：成品中组织蛋白酶B、L活性相比于鲜鱼均呈现出增高趋势，HS法成品中组织蛋白酶H活性低于鲜鱼中组织蛋白酶H活性，而LAS法中组织蛋白酶H活性高于鲜鱼中组织蛋白酶H活性。由此可见，原料以及加工方式不同导致的加工过程中加工环境各异，将对腌干鱼类制品中蛋白酶活性的变化产生不同的激活或抑制作用。

图4-40　蓝圆鲹腌干工艺加工过程中组织蛋白酶H活性变化情况

注：同一条线上的不同小写字母表示同一工艺不同加工阶段酶活差异性显著（p<0.05）；不同线上的不同大写字母表示不同工艺中相同加工阶段酶活差异性显著（p<0.05）。

由图4-40可见，两种蓝圆鲹腌干工艺加工过程中组织蛋白酶B、L、H的变化趋势相似，HS法中组织蛋白酶B的活性在腌制、脱盐阶段变化不显著，烘干阶段活性显著增高（p<0.05），到烘干末期活性达到最大值；LAS法中组织蛋白酶B的活性在腌制阶段略有增加，脱盐阶段活性出现回落趋势，烘干阶段活性显著提升（p<0.05），在烘干中后期活性达到最大值。组织蛋白酶H的活性在腌制阶段呈现出显著降低的趋势（p<0.05），之后活性显著增强，至烘干阶段达到最大值（与新鲜鱼中活性值大小相仿），整个加工阶段LAS法中组织蛋白酶H和L活性大于HS法中酶的活性（p<0.05）。由此可见食盐含量对组织蛋白酶影响较大，食盐含量较低时有利于激活组织蛋白酶活性，食盐含量较高时就抑制了组织蛋白酶活性；由于HS法中食盐含量较LAS法高，所以在腌制阶段LS法的组织蛋白酶活性大于HS法。而烘干阶段组织蛋白酶B、L、H活性均显著提升（p<0.05），在烘干中后期活性达到最大值，说明烘干过程的温度是组织蛋白酶的最适宜温度，所以活性增强。

（三）蓝圆鲹腌干工艺加工过程中蛋白降解情况分析(www.xing528.com)

图4-41中体现了不同加工工艺腌干蓝圆鲹加工过程中蛋白水解指数（P.I.）的变化规律，研究人员在火腿加工过程中发现火腿特征风味与肽类成分及含量具有密切的相关性。由图4-41可见，P.I.在HS法和LAS法腌干蓝圆鲹加工过程中变化趋势相同：P.I.随加工的进行同样呈现出逐渐增高的趋势。两种加工工艺各加工阶段中样品蛋白的降解率P.I.在腌制、脱盐阶段LAS法大于HS法，烘干中期及成品中则为HS法大于LAS法，说明HS法生产的腌干鱼制品蛋白降解程度略高于LAS法制备的腌干蓝圆鲹，LAS法有利于减轻腌干鱼制品的蛋白降解程度。有研究表明，若P.I.<22，说明蛋白质水解不够，导致缺乏应有香气和滋味；若P.I.>30，则表现出蛋白质水解过度，导致质地过软，呈现出明显苦味或金属后味。本研究中HS法和LAS法生产的腌干蓝圆鲹P.I.值分别为23.99和23.08，22<P.I.<30，说明均不会产生明显的苦味或者金属后味。

图4-41　蓝圆鲹腌干工艺加工过程中组织蛋白酶H活性变化情况

注：同一条线上的不同小写字母表示同一工艺不同加工阶段酶活性差异显著（p<0.05）； 不同线上的不同大写字母表示不同工艺中相同加工阶段酶活性差异显著（p<0.05）。

（四）蓝圆鲹腌干工艺加工过程中游离氨基酸变化与滋味形成的分析对比

表4-38为蓝圆鲹腌干工艺加工过程中游离氨基酸变化情况，由表可见，随着加工进程的不断推进，HS法和LAS法生产过程中总游离氨基酸（TFAA）含量变化趋势相同：腌制、脱盐阶段均出现显著下降趋势（p<0.05），主要原因是水溶性游离氨基酸随水分逐渐流失；烘干阶段TFAA含量显著增加（p<0.05），说明腌干咸鱼中游离氨基酸主要生成于烘干阶段。TFAA含量在腌制、脱盐阶段HS法<LAS法，而烘干阶段HS法>LAS法。在腌制、脱盐两阶段中，由于LAS法中组织蛋白酶B、L活性略大于HS法中活性，使得LAS法中多肽含量较高，在氨肽酶作用下产生较多的游离氨基酸；但烘干阶段两种组织蛋白酶活性则是HS法大于LAS法，促进了HS法中多肽的生成，使得烘干阶段TFAA含量为HS法大于LAS法。TFAA对腌制品的滋味影响较大，研究发现游离氨基酸是火腿酸味、甜味和苦味的前体物，与火腿风味的形成具有巨大相关性。丙氨酸能产生甜味，苦感的产生与高浓度的蛋氮酸、亮氨酸和异亮氨酸有关，谷氨酸和天冬氨酸具有鲜味。由表4-38可见，两种腌干蓝圆鲹加工过程中总呈味氨基酸含量百分比（PFAA）的变化趋势相同，均随着加工的进行含量百分比逐渐增高，虽然HS法加工制作的腌干蓝圆鲹中TFAA含量高于LAS法，但PFAA（%）为LAS法> HS法；苦味氨基酸（与苦味前体物质相关的氨基酸）含量百分比（BFAA）在HS法中主要增高阶段为腌制、烘干前期，LAS法主要增高阶段为腌制、烘干末期，这可能与LAS法中复合乳酸菌的发酵作用相关性较高有关；鲜味氨基酸含量百分比（UFAA）在脱盐、烘干期间均逐渐增高，特别是烘干末期，成品中UFAA（%）为LAS法>HS法，这是由于复合乳酸菌的发酵降解产生了较多的鲜味氨基酸；甜味氨基酸含量百分比（SFAA）主要在烘干前期增加较明显，且成品中SFAA（%）为LAS法>HS法。由以上分析可见，LAS法更有利于腌干鱼滋味物质的产生。

（五）蓝圆鲹腌干工艺加工过程中组织蛋白酶与蛋白降解和游离氨基酸的相关性分析

将两种蓝圆鲹腌干工艺加工过程中组织蛋白酶活性与蛋白降解率及呈味游离氨基酸含量通过SPSS软件中的Pearson相关系数进行相关性分析。HS法中组织蛋白酶B与P.I.值、TFAA、BFAA、DFAA、SFAA、PFAA均呈现出正相关性，且相关性极显著（p<0.01），LS法中组织蛋白酶B与P.I.值呈现出极显著正相关性（p<0.01），TFAA、BFAA、DFAA、SFAA、PFAA均呈现出显著相关性（p<0.05），说明组织蛋白酶B在两种腌干工艺中均发挥较大作用。HS法和LAS法中组织蛋白酶L、H与P.I.值、BFAA、DFAA、SFAA、PFAA均呈现出正相关性，但相关性均不显著，这说明腌干蓝圆鲹加工过程中组织蛋白酶L、H对蛋白降解的作用较小。组织蛋白酶L在LAS法中与TFAA呈现出显著正相关性（p<0.05），但HS法中正相关性不显著，组织蛋白酶H对蛋白的降解作用为LAS法>HS法，由此可推测在蓝圆鲹腌干过程组织蛋白酶B对蛋白降解及滋味物质的产生的作用大于组织蛋白酶L和H。

火腿加工过程中蛋白质水解产生的游离氨基酸和小分子多肽是其滋味物质的主要组成部分，多肽一般呈苦味，亲脂性残基增强其苦味感。部分游离氨基酸本身具有特殊滋味，另一部分能够通过降解反应或美拉德反应生成火腿的特殊风味物质，其中带侧链的化合物一般是由游离氨基酸参与形成。本实验中各酶与P.I.值及呈味氨基酸之间的关系，可推断组织蛋白酶B、L在腌干蓝圆鲹加工的蛋白降解过程中发挥一定作用，其中组织蛋白酶B发挥主要作用。

综上所述，两种蓝圆鲹腌干工艺均利于组织蛋白酶B、L活性的提升，且组织蛋白酶B、L活性均在烘干末期达到最大值；整个加工过程组织蛋白酶H的活性是LAS法>HS法，在腌制阶段组织蛋白酶H均显著下降（p<0.05），在脱盐和烘干阶段活性显著提高，但总体活性较鲜鱼中活性变化不显著。TFAA、PFAA含量均在烘干阶段显著增加，成品中：P.I.值为HS法>LAS法，TFAA含量为HS法>LAS法；PFAA（%）为LAS法>HS法。LAS法能够在减少蛋白降解率的同时提升制品中呈味氨基酸含量百分比，相对于HS法来说LAS法更有利于丰富制品中的滋味物质。HS法和LAS法加工过程中：组织蛋白酶B活性较组织蛋白酶L活性稳定；在蛋白降解及呈味游离氨基酸的生成过程中组织蛋白酶发挥的作用大小为组织蛋白酶B>组织蛋白酶L，组织蛋白酶B对蛋白降解的作用是HS法 >LAS法；组织蛋白酶H对制品中蛋白降解及游离氨基酸的生成的作用较小。通过以上的研究表明可以从控制加工过程中内源性蛋白酶类活性入手改进传统腌干鱼加工工艺，通过适当方法控制组织蛋白酶B、L活性，促进制品中呈味氨基酸含量百分比的增加，减少或者消除不适宜的产品风味。同时本研究发现虽然腌干鱼中的组织蛋白酶B在HS法中发挥的活性作用大于LAS法，使得P.I.值LAS法<HS法，增加了HS法中TFAA含量，但PUFA比例并未增加，因此LAS法由于复合乳酸菌的发酵作用，更利于腌干鱼营养价值的保存及滋味物质的形成。LAS法更符合人们对于低盐食品的要求，此腌干工艺具有巨大的可开发空间，可以用于其他腌制肉制品中，以提升更多其他肉制品产品的风味和营养价值。