微生物法低盐快速腌干技术优化

（一）腌制工艺的选择

（1）干腌：按照鱼∶盐=5∶1（质量比）的比例添加食盐，使其均匀分布在鱼体表面和鱼肚内，一起放在大小合适的容器内，使鱼体平整堆叠在一起，封盖室温放置。

（2）混合腌制法：将原料鱼摆放在洁净容器内，一层鱼一层盐，并加入适量的饱和食盐水，刚好盖过鱼体表面，室温放置，封盖腌制。

（3）低温湿腌法：采用4℃，10%盐水和3%海藻糖进行腌制，鱼∶盐水（质量体积比）为1∶1，封盖腌制。

由表4-24可知，采用不同的腌制方法，腌制鱼的NaCl含量（%）、TVB-N值（mg/100g）、过氧化值（g/100g）、感官评分有显著差异。传统干腌法腌制鱼肉，腌制24h，感官品质最佳，但鱼肉中食盐的渗透不均匀，内部鱼肉过淡，鱼肉颜色发白，造成鱼肉品质较差；腌制48h后，过氧化值能增加至0.045 g/100g，显著高于低温湿腌鱼肉（p<0.05），NaCl含量为12.06%，不适宜菌株的生长。混合腌制法肉质太硬，随着腌制时间的增加，鱼体脱水明显，鱼肉的感官品质显著降低，但鱼肉色泽较好；腌制48h后，NaCl含量增加至13.63%，说明食盐渗透速率较其他方法显著增加，但抑制了有益微生物的生长。低温湿腌法是采用4℃腌制，并且加入了3%的海藻糖，对鱼肉新鲜度及蛋白质保护较好，而且盐含量比较适宜，腌制鱼肉的感官品质较其他腌制方法好：腌制24h后，鱼肉盐渗透均一，硬度适中，感官分值为74.8，且NaCl含量为6.01%，不会抑制乳酸菌株的生长；同时鱼肉的过氧化值也较低，为0.031（g/100g），显著低于其他方法腌制鱼肉；腌制48h，鱼肉的感官品质略有下降，过氧化值也增大至0.037（g/100g）。综上所述，腌制效果最好的工艺是低温湿腌法，腌制时间为24h。后续试验腌制鱼肉均采用低温湿腌法。

表4-24　鱼肉在不同腌制方法及时间下的理化指标

注：同列值有不同字母上标者表示彼此差异显著（p<0.05）。

（二）不同乳酸菌株对鱼肉感官品质的影响

1.不同接种方式及菌种复配比例分析

将5种乳酸菌株分别扩大培养到菌落总数达109 cfu/mL，再按一定用量接种于最佳工艺腌制的红牙中进行正交试验，试验采用菌悬液浸渍鱼体、菌悬液喷雾鱼体、菌悬液注射鱼体三种发酵腌制方法。不同腌制方式的正交试验结果如表4-25所示；A、B、C、D、E分别代表乳酸菌Lp、Pp、Lm、La 、Lb。

采用菌悬液浸渍鱼体法，不同菌种对发酵鱼品质的影响顺序为Lp>Lm>La>Pp>Lb，从直观分析结果可以得出：最优的发酵剂配比为Lp∶Pp∶Lm∶La∶Lb=4∶4∶2∶3∶1。采用菌悬液喷雾法，不同菌种对发酵鱼品质的影响顺序为Lp>Lm>Lb >La>Pp，分析结果得出：最优的复合菌种配比为Lp∶Pp∶Lm∶La∶Lb=4∶2∶2∶4∶3。采用菌悬液注射法，不同菌种对发酵鱼品质的影响顺序为Lp>Pp>Lm>La>Lb，分析结果得出：最优的复合菌种配比为Lp∶Pp∶Lm∶La∶Lb=4∶4∶2∶3∶4。试验结果表明，采用不同的发酵方法，得到最优发酵菌种复配比也不同，并且菌种对发酵鱼品质的影响顺序也不同，其中，三种方法中，Lp对鱼肉品质的影响最显著，随着菌株Lp接种比例的增大，鱼肉pH呈现逐渐下降的趋势，说明Lp对鱼肉pH的影响显著（p<0.05）。

2.不同接种方式正交试验结果方差分析

不同腌制方式的正交试验结果方差分析显示，采用的三种不同接种方式中（菌悬液浸渍法、菌悬液喷雾、菌悬液注射），五种乳酸菌株（Lp、Pp、Lm、La、Lb）对鱼肉的感官品质均有极显著的影响（p<0.01）。五种乳酸菌株对鱼肉品质的改善及感官品质的提升均起到重要的作用，多菌种混合发酵可以丰富产品风味，改善鱼肉品质。

3.最佳接种方式及乳酸菌复配比例的确定

按照正交试验得出的最优菌种复配比，进行三种不同接种方式的最优试验，以鱼肉的pH、TVB-N值、氨基酸态氮含量、总酸含量、总蛋白含量、亚硝酸含量和感官评分为指标，确定最佳的接种方式和最优的菌种复配比例。不同接种方式的最优试验结果如表4-26所示。由表可知，采用菌悬液喷雾法和注射法发酵的鱼感官评分都超过70分，pH降至5.8左右，能满足发酵要求。而采用菌悬液浸泡发酵的鱼感官评分最低，pH降低速度较慢，不利于发酵。氨基酸态氮的含量随着发酵时间的增加而增加，采用菌悬液注射法腌制的鱼肉的氨基酸态氮含量增加至0.302%，显著高于其他两种接种方法。GB2733—2005《鲜冻动物性水产品卫生标准》中规定，海水鱼的TVB-N值应不高于30mg/100g。由表4-26可知，采用三种发酵方式所得产品的TVB-N值相差不大，且均小于30mg/100g，符合安全食用标准要求。采用三种方法得到的腌干鱼制品的亚硝酸盐含量均较低，但菌悬液注射法得到的最终产品的亚硝酸盐含量最低，这可能是因为每种方法的各种菌液的配比不同，注射法中植物乳杆菌和短乳杆菌的比例较高，且降解亚硝酸盐的能力较强。结果表明，采用菌悬液注射法和对应的五种菌株的复配比例（Lp∶Pp∶Lm∶La∶Lb= 4∶4∶2∶3∶4），腌制鱼肉的感官品质最好，氨基酸态氮含量最高，亚硝酸盐含量最低，发酵速率最快。所以试验确定最佳的接种方式为注射鱼肉接种法，菌株之间最优的复配比例为Lp∶Pp∶Lm∶La∶Lb=4∶4∶2∶3∶4。

表4-26　不同腌制方式的最优试验对比

（三）不同单因素对腌制咸鱼品质的影响

1.不同发酵温度对腌制咸鱼品质的影响

在接种量8%、发酵时间24h的条件下，考察不同发酵温度对咸鱼品质的影响，结果见表4-27。随着温度的升高，鱼肉的感官评分先升高后降低，TVB-N值逐渐升高。在温度为30℃时，感官评分最高，此时的感官品质最佳（p<0.05）。温度增加至30℃时，鱼肉氨基酸态氮含量也显著地增加至0.304%，较25℃时，氨基酸态氮含量显著增加（p<0.05），而温度由30℃增加至40℃，氨基酸态氮含量没有发生显著变化。在45℃，鱼肉氨基酸态氮含量显著增加（p<0.05），这是由于温度升高，蛋白质降解形成大量的氨基酸导致的，此时的感官质量较差，出现腐败味，其TVB-N值为30.717mg/100g，已经超过GB2733-2005《鲜冻动物性水产品卫生标准》中的规定，不符合食品安全要求。鱼肉的pH的变化是随着温度的升高先降低后升高，在30℃时鱼肉的pH最低，这是由于乳酸菌最适宜的温度约为30℃，乳酸菌生长旺盛，产生大量的乳酸，降低了鱼肉的pH。鱼肉总蛋白含量在发酵温度为30℃和35℃时的变化较其他温度显著（p<0.05），30℃下总蛋白含量的降低可能与乳酸菌的生长代谢有关，30～35℃适宜乳酸菌的大量生长繁殖，代谢分解了蛋白质类相关的物质，减少了总蛋白含量。鱼肉总酸含量在35℃条件下达到最高值0.343%，这是由于乳酸菌的大量生长代谢，产生了大量的乳酸类物质，增加了鱼肉的总酸含量。试验结果表明：在发酵温度为30℃下，鱼肉的感官品质最佳，鱼肉的氨基酸态氮含量较高，满足试验要求。所以最佳的发酵温度为30℃左右。

表4-27　不同发酵温度对腌制咸鱼肉品质的影响

注：同列值有不同字母上标者表示彼此差异显著（p<0.05）。

2.不同接种量对腌制咸鱼品质的影响

在发酵温度为30℃、发酵时间24h的条件下，考察不同接种量对咸鱼品质的影响，结果见表4-28。随着接种量由4%增加至12%（体积质量比），感官评分呈现出先升高后降低的趋势，氨基酸态氮含量先急剧上升后保持平稳，鱼肉pH逐渐降低，而总酸含量连续上升。接种量在8%～10%时，鱼肉的感官评分值为71.40，较其他接种量具有更佳的鱼肉品质（p<0.05），氨基酸态氮含量较其他接种量具有更高的水平（p<0.05）。鱼肉的pH降低、总酸含量升高是由于乳酸菌接种量增大，乳酸菌生长代谢产生大量乳酸所致。总蛋白含量的变化不显著（p>0.05），这可能是由于乳酸菌在分解一定量蛋白质的同时又产生了蛋白质类相关的营养物质，导致总蛋白的含量没有显著变化。TVB-N的最大值为22.651mg/100g，符合GB2733—2005《鲜冻动物性水产品卫生标准》中规定的要求。试验结果表明：接种量在8%～10%范围内，鱼肉具有最佳的感官品质，氨基酸态氮含量较高，TVB-N值在要求范围内，满足试验要求。所以最佳接种量在10%左右。

表4-28　不同接种量对腌制咸鱼肉品质的影响

3.不同发酵时间对腌制咸鱼品质的影响

在发酵温度为30℃，接种量为8%（V/W）的条件下，考察不同发酵时间对咸鱼品质的影响，结果见表4-29。随着发酵时间的增加，氨基酸态氮含量呈现上升的趋势，发酵24h的氨基酸态氮含量为0.311%，较发酵18h有显著增加（p<0.05）。发酵24h后，氨基酸态氮的含量变化不显著。感官评分在发酵24h后取得最高值72.40分，说明经过乳酸菌发酵24h，鱼肉具有的感官品质最佳。鱼肉总酸含量随着发酵时间的增加而升高，这是由于乳酸菌大量生长产生的乳酸所致；总蛋白含量随着发酵时间的增加变化不显著，说明整个发酵过程乳酸菌代谢分解的蛋白质和代谢形成的蛋白质类似物基本相同。TVB-N值随着发酵时间的增加也显著升高，说明随着发酵时间的增加，大量的微生物的生长，尤其是一些腐败微生物的生长，鱼肉开始变质，导致挥发性盐基氮含量增加，TVB-N的最大值为28.882mg/100g，符合GB2733—2005《鲜冻动物性水产品卫生标准》中的要求。试验结果表明：经乳酸菌作用18～24h后，鱼肉具有最佳的感官品质，而且氨基酸态氮含量也保持在较高的水平，TVB-N值在要求范围内，满足试验要求。所以最佳的发酵时间为18h左右。(www.xing528.com)

表4-29　不同发酵时间对腌制咸鱼肉品质的影响

续上表

4.单因素实验方差分析

利用SPSS软件对不同单因素（温度、接种量、时间）对鱼肉的pH、氨基酸态氮含量（%）、总蛋白含量（%）、总酸含量（%）、TVB-N值（mg/100g）及感官评分进行方差分析。结果表明，三个单因素除了对总蛋白含量的影响不显著外，其对鱼肉的pH、氨基酸态氮含量（%）、总酸含量（%）、TVB-N值（mg/100g）及感官评分的影响均呈现出显著（p<0.05）或极显著的差异（p<0.01）。说明试验所选取的三个单因素对鱼肉质量均有显著影响，其中温度的最适范围为25～35℃，接种量的最适范围为8%～12%（V/W），发酵时间的最适范围为12～24h，所以在下面的试验中，以此范围为基础，进行响应面设计试验。

（四）响应面设计与分析

1.响应面试验设计与结果

采用设计软件Design Expert进行实验设计、统计分析和模型构建。采用三因素三水平的BBD试验设计研究响应值以及最佳变量的组合。以腌制温度X1（℃）、接种量X2（V/W，%），时间X3（h）为考察因素，以鱼肉的pH、总酸含量、TVB-N含量、氨基酸态氮含量和感官评分值为响应指标进行分析，并分别建立感官评分值和氨基酸态氮含量与X1、X2和X3之间的数学模型。试验设计及结果见表4-30。

表4-30　Box-Behnken试验设计表及结果

续上表

2.数学模型的建立与分析

试验结果经Design Expert 8.05进行统计分析，分别模拟出了鱼肉的pH、总酸含量、TVB-N含量、氨基酸态氮含量和感官评分与腌制温度X1、接种量X2、发酵时间X3之间的数学模型，见表4-31。

表4-31　不同指标的二次多项式回归方程

其中，鱼肉的pH和总酸含量分别与温度、接种量、发酵时间之间建立的二次多项式回归方程模型不显著，表明这两个方程不能够准确地反映真实的实验值。而TVB-N含量、氨基酸态氮含量和感官评分值分别与腌制温度、接种量、发酵时间之间建立的二次多项式回归方程模型极显著（p<0.01），说明模型在概率p= 0.01的水平上能够拟合试验数据。感官评分（Y1）的回归模型相关系数R2=98.77%，并且失拟项对模型不显著，且信噪比=22.697>4，说明模型的精密度很高。变异系数（Cv）反映模型的置信度，变异系数（Cv）为 2.01%，此值较小，说明模型的置信度高，能够很好地反映真实值，可以使用该模型来分析响应值的变化。氨基酸态氮含量（Y2）的回归模型相关系数R2=91.59%>90%，并且失拟项对模型不显著，变异系数（Cv）为6.75%，并且信噪比=8.067>4，说明该模型的精确度和置信度均较高，可以使用该模型来分析响应值的变化。然而，TVB-N含量（Y5）回归方程相关系数R2只有66.55%，仍有33.45%的试验值不能准确预测，说明该模型对实际试验拟合度不高，不够精密，所以不考虑TVB-N含量（Y5）的回归方程模型。因素温度和时间对感官评分有极显著的影响（p<0.01），由F值可知，三个因素对鱼肉感官品质的影响顺序为：温度>时间>接种量。只有因素温度对氨基酸态氮含量的影响显著（p<0.05），而时间和接种量对其影响不显著，由F值可知，三个因素对鱼肉氨基酸态氮含量的影响顺序为：温度>接种量>时间。温度对鱼肉感官质量和营养价值均有显著的影响。

3.响应面模型分析与条件优化

感官评分（Y1）和氨基酸态氮含量（Y2）模型的真实值和预测值的对比及残差正态图分别见图4-33和图4-34。在真实值和预测值的对比图中，所有的点均沿着对角线集聚分布，表明模型能够准确预测。在残差正态图中，所有的点呈现线性分布模式，表明模型误差项验证满足要求。三维响应面曲线和二维等高线图通常用于显示两个研究变量之间的相互作用的类型和响应之间的关系，当其中一个因素在0水平，另两个独立因素与响应值的模型图见图4-33和图4-34。不同形状的轮廓图表示不同变量之间的相互作用。响应曲面图可以直观地反映两变量交互作用的显著程度，圆形表示两个因素交互作用不显著，而椭圆形与之相反。

当接种量不变，随着温度的增加，感官品质逐渐下降，呈负相关变化.这是由于温度的升高，加快了鱼肉的腐败变质速度；而氨基酸态氮含量呈现先增加后下降的趋势，是由于温度在上升的过程中处于某一中间值时，乳酸菌大量生长繁殖，分解蛋白质生成大量的游离氨基酸。当发酵温度不变，接种量增加时，鱼肉的感官评分也呈现增加后降低的趋势，但整体变化大，说明接种量对感官品质的影响不显著；而氨基酸态氮含量变化呈现逐渐增加的趋势，这是由于乳酸菌接种量变大，分解蛋白质的菌株总数增加，使得氨基酸态氮含量增加。

发酵温度和时间的交互作用对鱼肉感官品质有着极显著的影响（p<0.01）。当发酵时间不变，随着温度的增加，感官品质逐渐下降，呈负相关变化。这是温度的升高，鱼肉的腐败变质速度加快导致的结果；而氨基酸态氮含量的变化是先增加后下降，这是因为某一中间温度是菌株生长的最佳温度，促使乳酸菌大量生长繁殖，分解蛋白质生成大量的游离氨基酸。当发酵温度不变，发酵时间延长时，感官评分呈现先升高后降低的趋势。这是因为在一定的发酵时间内，乳酸菌大量生长繁殖，产生特有的风味，提升鱼肉的感官值；而当超过合适的发酵时间，腐败菌大量繁殖，鱼肉腐败加速，严重影响鱼肉感官品质。氨基酸态氮含量随着发酵时间的增加而增大，这是由于乳酸菌的生长代谢的作用，累计产生量随时间的增加而增加。

图4-33　鱼肉感官评分值模型的预测值与真实值对比图（a）、残差正态图（b）及三维响应面图（c、d、e）

当发酵时间不变，接种量增加时，鱼肉的感官评分也呈现先增加后降低的趋势，氨基酸态氮含量变化呈现逐渐增加的趋势。当接种量不变，发酵时间增加时，感官评分呈现先升高后降低趋势，氨基酸态氮含量随着发酵时间的增加而增大。

运用Design Expert 8.05软件对回归模型进行分析，结合回归方程的三维响应面图和等高线图，可确定发酵腌制鱼肉的最佳工艺条件为：发酵温度为 27.38℃，接种量为10.23%，发酵时间为17.69 h。结合实际生产条件，确定最佳工艺条件为：发酵温度为27℃，接种量为10%，发酵时间为17 h。

图4-34　鱼肉氨基酸态氮含量模型的真实值与预测值对比图（a）、残差正态图（b）及三维响应面图（c、d、e）

4.最优验证试验

最佳条件的模型预测结果：pH为5.89，总酸含量为0.3231%，TVB-N值为25.3382mg/100g，氨基酸态氮含量为0.2935%，感官评分值为75.1分。根据试验确定的最佳腌制工艺条件：发酵温度27℃，接种量为10%，发酵时间为17 h，进行验证试验，与模型预测的结果进行比较。试验测得的结果为：pH为5.81，总酸含量为0.332%，TVB-N值为24.488mg/100 g，氨基酸态氮含量为0.304%，感官评分值为74.8分。试验测得各项指标值和模型预测值偏差<2%，说明模型预测值准确度高，可见该模型可以较好地预测实际试验情况，从而也证明了响应面法在优化接种菌咸鱼发酵条件方面的可行性。

综上所述，比较分析不同腌制方法对鱼肉品质的影响，结果表明：采用低温湿腌法（即4℃、10%盐水和3%的海藻糖腌制液），腌制的鱼肉盐渗透均一，硬度适中，感官品质最好，感官分值达到74.8分，且NaCl含量为6.01%，适宜乳酸菌株的生长；而且鱼肉的过氧化值为0.031g/100g，显著低于其他方法腌制的鱼肉。通过正交试验对菌悬液的接种方式和菌株复配比例进行分析，结果得出：最佳的接种方式为注射鱼肉接种法，菌株之间最优的复配比例为Lp∶Pp∶Lm∶La∶Lb=4∶4∶2∶3∶4。不同菌种对发酵鱼品质的影响顺序为Lp>Pp>Lm>La>Lb，并且五种乳酸菌株对鱼肉的感官品质均有极显著的影响。采用菌悬液注射法和对应的五种菌株复配比例腌制加工的鱼肉，与采用其他接种方式和对应的菌种复配比例腌制鱼相比，具有更好的感官品质，且氨基酸态氮含量较高，亚硝酸盐含量较低，发酵速率较快。通过单因素试验和响应面试验，建立了低盐乳酸菌法快速加工咸鱼的最佳工艺条件为：发酵温度为27℃，接种量为10%，发酵时间为17h。五种乳酸菌按照复合比例Lp∶Pp∶Lm∶La∶Lb=4∶4∶2∶3∶4接种到鱼体，在此工艺条件下，鱼肉的pH为5.81，总酸含量为0.332%，TVB-N 值为24.488mg/100g，氨基酸态氮含量为0.304%，感官评分值为74.8分。这说明乳酸菌应用于咸鱼加工，可以显著缩短加工时间，提升鱼肉的感官品质和风味。建立感官评分值（Y1）和氨基酸态氮含量（Y2）与因素X1，X2和X3之间的数学模型如下：