高效液相色谱法-实验实训

1.试剂

所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的一级水。

（1）氯霉素标准品：含量≥97%。

（2）内标物：氘代氯霉素标准品，含量为100μg/mL（作为内标物标准储备液）。

（3）甲醇：色谱纯。

（4）乙腈：色谱纯。

（5）乙酸乙酯。

（6）氯化钠。

（7）正己烷。

（8）C18固相萃取柱：500mg/3mL，或相当者。

（9）4%氯化钠溶液：取氯化钠4g，用水溶解并稀释至100mL。

（10）100μg/mL氯霉素标准储备液：精密称取氯霉素标准品10mg，于100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为100μg/mL的氯霉素标准储备液。-20℃以下保存，有效期1年。

（11）100μg/L氯霉素标准工作溶液：精密量取100μg/mL氯霉素标准储备溶液100μL，于100mL量瓶中，用50%乙腈溶解并稀释至刻度，配制成浓度为100μg/L的标准工作液。2℃～8℃保存，有效期1个月。

（12）20μg/L氘代氯霉素标准工作溶液：精密量取氘代氯霉素标准品20μL，于1000mL量瓶中，用50%乙腈溶解并稀释至刻度，配制成浓度为20μg/L的氘代氯霉素标准工作液。2℃～8℃保存，有效期3个月。

2.仪器设备

（1）分析天平：感量0.00001g；

（2）液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。

液相色谱条件：色谱柱，C18（150mm×2.1mm，粒径5μm），或相当者；柱温30℃流速0.2mL/min；进样量20μL；运行时间8min；流动相，乙腈+水（50+50，V/V）。

质谱条件：电离模式，ESI；扫描方式，负离子扫描；检测方式，多反应检测；电离电压2.8kV；源温120℃；雾化温度350℃；锥孔气流速50L/h；雾化气流速450L/h；数据采集窗口8min；驻留时间0.3s；定性、定量离子及对应的锥孔电压和碰撞电压见表6-5。

表6-5　氯霉素定性、定量离子对和锥孔电压及碰撞电压

（3）固相萃取装置。

（4）漩涡振荡器。

（5）振荡器。

（6）组织匀浆机。

（7）冷冻离心机。

（8）旋转蒸发仪。

（9）离心管：50mL。

（10）鸡心瓶：50mL。

（11）滤膜：0.22μm。

（12）氮吹仪。(www.xing528.com)

3.测定步骤

（1）步骤1：试样的制备。取适量新鲜或冷藏的空白样品或供试牛奶，混合，并使均质。取均质后的供试样品作为供试试料；取均质后的空白样品作为空白试料；取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。试料在-20℃以下保存。

（2）步骤2：样品测定。

①提取：取试料10±0.05g于50mL离心管中，加氘代氯霉素内标工作液250μL，再加乙酸乙酯20mL，振荡15min，6000r/min离心10min，取乙酸乙酯层液于鸡心瓶中，再加乙酸乙酯20mL重复提取一次，合并两次提取液于鸡心瓶中，于45℃水浴旋转蒸发至干，用4%氯化钠溶液5mL溶解残留物，加正己烷5mL振荡混合1min，静置分层，弃正己烷液，再加正己烷5mL，重复提取一次。取下层液备用。

②净化：C18柱依次用甲醇5mL和水5mL活化，取备用液过柱，控制流速1滴/（3～4s），用水5mL淋洗，抽干，用甲醇5mL洗脱，收集洗脱液，于50℃氮气吹干。用50%乙腈1.0mL溶解残余物，涡旋混匀，滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱测定。

③标准曲线的制备：精密量取100μg/L氯霉素标准工作溶液和20μg/L 氘代氯霉素内标工作溶液适量，用流动相稀释，配制成氯霉素浓度为0.10μg/L、0.25μg/L、0.50μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L，氘代氯霉素浓度为5μg/L的系列标准溶液，供液相色谱-串联质谱仪测定。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。

④测定：取试样溶液和相应的标准溶液，做单点或多点校准，按内标法以峰面积比计算。对照溶液及试样溶液中氯霉素和氘代氯霉素的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。空白试验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。

试样溶液中的离子相对丰度与标准溶液的离子相对丰度比符合表6-6的要求。标准溶液和空白组织添加试样溶液的总离子流和选择离子流图见图6-1～图6-3。

表6-6　试样溶液中离子相对丰度的允许偏差范围

图6-1　氯霉素标准溶液总离子和特征离子质量色谱图（0.25μg/L）

图6-2　牛奶空白试样特征离子质量色谱图

（3）步骤3：计算结果。计算A321/151.6/A325.5/156.6。峰面积比值，标准曲线校准。由标准曲线方程：

求得a和b，则

试料中氯霉素残留量按下式计算：

式中：X——供试试料中氯霉素的残留量，μg/kg；

As——对照溶液中氯霉素的峰面积；——对照溶液中内标氘代氯霉素的峰面积；

cs——对照溶液中内标氘代氯霉素的浓度，ng/mL；——对照溶液中氯霉素的浓度，ng/mL；

c——供试溶液中氯霉素的浓度，ng/mL；

A——试样中氯霉素的峰面积；

Ais——试样中内标氘代氯霉素的峰面积；

V——溶解残余物的体积，mL；

m——供试试料质量，g。

注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字；本方法检测限为0.01μg/kg，定量限为0.1pg/kg。

图6-3　牛奶空白添加氯霉素试样总离子和特征离子质量色谱图（0.02μg/kg）