分光光度法实验实训

分光光度法的原理为：试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，外标法测得亚硝酸盐含量，采用镉柱将硝酸盐还原成亚硝酸盐，测得亚硝酸盐总量，由此总量减去亚硝酸盐含量，即得试样中硝酸盐含量。

1.试剂

除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

（1）亚铁氰化钾溶液（106g/L）：称取106.0g亚铁氰化钾［K4Fe（CN）6·3H2O］，用水溶解，并稀释至1000mL。

（2）乙酸锌溶液（220g/L）：称取220.0g乙酸锌［Zn（CH3COO）2·2H2O］，先加30mL冰醋酸溶解，用水稀释至1000mL。

（3）饱和硼砂溶液（50g/L）：称取5.0g硼酸钠（Na2B4O7·10H2O），溶于100mL热水中，冷却后备用。

（4）氨缓冲溶液（pH值为9.6～9.7）：量取30mL盐酸（ρ=1.19g/mL），加100mL水，混匀后加65mL氨水（25%），再加水稀释至1000mL，混匀，调节pH值为9.6～9.7。

（5）氨缓冲液的稀释液：量取50mL上述氨缓冲溶液，加水稀释至500mL，混匀。

（6）盐酸（0.1mol/L）：量取5mL盐酸，用水稀释至600mL。

（7）对氨基苯磺酸溶液（4g/L）：称取0.4g对氨基苯磺酸（C6H7NO3S），溶于100mL 20%盐酸（体积比）中，置于棕色瓶中混匀，避光保存。

（8）盐酸萘乙二胺溶液（2g/L）：称取0.2g盐酸萘乙二胺（C12H14N2·2HCl），溶解于100mL水中，混匀后，置于棕色瓶中，避光保存。

（9）亚硝酸钠标准溶液（200μg/mL）：准确称取0.1000g于110℃～120℃干燥恒重的亚硝酸钠，加水溶解，移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

（10）亚硝酸钠标准使用液（5.0μg/mL）：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液5.00mL，置于200mL容量瓶中，加水稀释至刻度。

（11）硝酸钠标准溶液（200μg/mL，以亚硝酸钠计）：准确称取0.1232g于110℃～120℃干燥恒重的硝酸钠，加水溶解，移入500mL容量瓶中，并稀释至刻度。

（12）硝酸钠标准使用液（5.0μg/mL）：临用时，吸取硝酸钠标准溶液2.50mL，置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度。

（13）锌皮或锌棒。

（14）硫酸镉。

2.仪器设备

（1）天平：感量为0.1mg和1mg。

（2）组织捣碎机。

（3）超声波清洗器。

（4）恒温干燥箱。

（5）分光光度计。

（6）镉柱或镀铜镉柱。

3.测定步骤

（1）步骤1：准备实验样品。

①新鲜蔬菜、水果的处理：将试样用去离子水洗净，晾干后，取可食部分切碎混匀，将切碎的样品用四分法取适量，用食物粉碎机制成匀浆，备用。如需加水应记录加水量。

②肉类、蛋、水产及其制品的处理：用四分法取适量或取全部，用食物粉碎机制成匀浆，备用。

③乳粉、豆奶粉、婴儿配方奶粉等固态乳制品（不包括干酪）的处理：将试样装入能容纳2倍试样体积的带盖容器中，通过反复摇晃和颠倒容器使样品充分混匀直至使试样均一化。

④发酵乳、乳、炼乳及其他液体乳制品的处理：通过搅拌或反复摇晃和颠倒容器使试样充分混匀。

⑤干酪的处理：取适量的样品研磨成均匀的泥浆状。为避免水分损失，研磨过程中应避免产生过多的热量。

（2）步骤2：试液的制备。

①提取：称取5g（精确至0.01g）制成匀浆的试样（如制备过程中加水，应按加水量折算），置于50mL烧杯中，加12.5mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以70℃左右的水约300mL将试样洗入500mL容量瓶中，于沸水浴中加热15min，取出置于冷水浴中冷却，并放置至室温。

②提取液净化：在振荡上述提取液时加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL乙酸锌溶液以沉淀蛋白质，加水至刻度，摇匀，放置30min，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液30mL，滤液备用。

（3）步骤3：准备镉柱。

①海绵状镉的制备：投入足够的锌皮或锌棒于500mL硫酸镉溶液（200g/L）中，经3～4h，当其中的镉全部被锌置换后，用玻璃棒轻轻刮下，取出残余锌棒，使镉沉底，倾去上层清液，以水用倾泻法多次洗涤，然后移入组织捣碎机中，加500mL水，捣碎约2s，用水将金属细粒洗至标准筛上，取20～40目的部分。(www.xing528.com)

②镉柱的装填：如图5-1所示，用水装满镉柱玻璃管，并装入2cm高的玻璃棉做垫，将玻璃棉压向柱底时，应将其中所包含的空气全部排出，在轻轻敲击下加入海绵状镉至8～10cm高，上面用1cm高的玻璃棉覆盖，上置一贮液漏斗，末端要穿过橡皮塞与镉柱玻璃管紧密连接。

图5-1　镉柱示意图

1.贮液漏斗，内径35mm，外径37mm；2.进液毛细管，内径0.4mm，外径6mm；8.橡皮塞；4.镉柱玻璃管内径12mm，外径16mm；5、7.玻璃棉；6.海绵状镉；8.出液毛细管，内径2mm，外径8mm

如无上述镉柱玻璃管时，可以25mL酸式滴定管代替，但过柱时要注意始终保持液面在镉层之上。当镉柱填装好后，先用25mL盐酸（0.1mol/L）洗涤，再以水洗两次，每次25mL，镉柱不用时用水封盖，随时都要保持水平面在镉层之上，不得使镉层夹有气泡。

③镉柱每次使用完毕后，应先以25mL盐酸（0.1mol/L）洗涤，再以水洗两次，每次25mL，最后用水覆盖镉柱。

④镉柱还原效率的测定：吸取20mL硝酸钠标准使用液，加入5mL氨缓冲液的稀释液，混匀后注入贮液漏斗，使其流经镉柱还原，以原烧杯收集流出液，当贮液漏斗中的样液流完后，再加5mL水置换柱内留存的样液，取10.0mL还原后的溶液（相当于10μg亚硝酸钠）于50mL比色管中，另吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0.0μg、1.0μg、2.0μg、3.0μg、4.0μg、5.0μg、7.5μg、10.0μg、12.5μg亚硝酸钠），分别置于50mL具塞比色管中，在以上比色管中分别加入2mL对氨基苯磺酸溶液（4g/L），混匀，静置3～5min后各加入1mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用2cm比色杯，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度，绘制标准曲线比较；同时做试剂空白。根据标准曲线计算测得结果，与加入量一致，还原效率应大于98%为符合要求。还原效率计算：

式中：X——还原效率，%；

A——测得亚硝酸钠的含量，μg；

10——测定用溶液相当于亚硝酸钠的含量，μg。

步骤4：样品测定。

①亚硝酸盐的测定：吸取40.0mL步骤2所得滤液于50mL具塞比色管中，另吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL。亚硝酸钠标准使用液（相当于0.0μg、1.0μg、2.0μg、3.0μg、4.0μg、5.0μg、7.5μg、10.0μg、12.5μg亚硝酸钠），分别置于50mL具塞比色管中，于标准管与试样管中分别加入2mL对氨基苯磺酸溶液（4g/L），混匀，静置3～5min后各加入1mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用2cm比色杯，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度，绘制标准曲线比较。同时做试剂空白。

②硝酸盐的测定：首先进行镉柱还原，以25mL氨缓冲液的稀释液冲洗镉柱，流速控制为3～5mL/min（以滴定管代替的可控制为2～3mL/min），吸取20mL滤液于50mL烧杯中，加5mL氨缓冲溶液，混合后注入贮液漏斗，使其流经镉柱还原，以原烧杯收集流出液，当贮液漏斗中的样液流尽后，再加5mL水置换柱内留存的样液，将全部收集液如前再经镉柱还原一次，第二次流出液收集于100mL容量瓶中，继以水流经镉柱洗涤三次，每次20mL，洗液一并收集于同一容量瓶中，加水至刻度，混匀；然后进行亚硝酸钠总量的测定，吸取10～20mL还原后的样液于50mL比色管中，另吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0.0μg、1.0μg、2.0μg、3.0μg、4.0μg、5.0μg、7.5μg、10.0μg、12.5μg亚硝酸钠），分别置于50mL具塞比色管中，于标准管与试样管中分别加入2mL对氨基苯磺酸溶液（4g/L），混匀，静置3～5min后各加入1mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用2cm比色杯，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度，绘制标准曲线比较。同时做试剂空白。

（5）步骤5：计算结果。

①亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）的含量计算：

式中：X1——试样中亚硝酸钠的含量，mg/kg；

A1——测定用样液中亚硝酸钠的质量，μg；

m——试样质量，g；

V1——测定用样液体积，mL；

V0——试样处理液总体积，mL。

注：以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字；在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

②硝酸盐（以硝酸钠计）的含量计算：

式中：X2——试样中硝酸钠的含量，mg/kg；

A2——经镉粉还原后测得总亚硝酸钠的质量，μg；

m——试样质量，g；

V2——测总亚硝酸钠的测定用样液体积，mL；

V0——试样处理液总体积，mL；

V3——经镉柱还原后样液总体积，mL；

V4——经镉柱还原后样液的测定用样液体积，mL；

X1——由公式计算出的试样中亚硝酸钠的含量，mg/kg。

1.232——亚硝酸钠换算成硝酸钠的系数。

注：以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字；在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。