脂溶性维生素的检验方法

（一）概述

脂溶性维生素具有以下理化性质。

1.溶解性

脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、苯、三氯甲烷、乙醚、乙醇、丙酮等有机溶剂。

2.耐酸碱性

维生素A、D对酸不稳定，对碱稳定；维生素E对酸稳定，对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下也能经受碱的煮沸。脂溶性维生素在脂肪酸败时可引起严重破坏。

3.耐热性、耐氧化性

维生素A、D、E耐热性好，能经受煮沸；维生素A易被空气、氧化剂所氧化，也能被紫外线分解；维生素D化学性质比较稳定，不易被氧化，但过量辐射可形成有毒化合物；维生素E在空气中能被慢慢氧化，光、热、碱能促进其氧化作用。

测定脂溶性维生素的方法较多，其中常见的方法有：薄层色谱法、分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法、GC-MS、LGMS等，在众多的方法中高效液相色谱法因具有快速、高效、高灵敏度等优点，是我国卫生标准分析方法之一。

（二）维生素A和维生素E的同时测定

维生素A是由β-紫罗酮环与不饱和一元醇组成的一类化合物及其衍生物的总称，包括维生素A1（视黄醇）和A2（3-脱氢视黄醇）及其各类异构体和衍生物，都具有维生素A的作用，总称为类视黄素。维生素A的量可用国际单位（IU）表示，每一个国际单位等于0.3μg维生素A（醇）、0.344μg乙酸维生素A（酯）。

维生素A的测定方法有三氯化锑比色法、紫外分光光度法、荧光法和高效液相色谱法等。国家标准中食品卫生检验方法的第一法是高效液相色谱法，可同时测定维生素A和维生素E，第二法是三氯化锑分光光度法测定维生素A。

维生素E是所有具有α-生育酚生物活性的苯并二氢呋喃衍生物的统称，属于酚类化合物。目前自然界中确认存在的维生素E有8种异构：α、β、γ、δ-生育酚和α、β、y、δ-三烯生育酚，其差别仅在于甲基的数目和位置不同。在较为重要的a、β、γ、δ-生育酚中，以α-生育酚的生理活性最强，一般所说的维生素E即指α-生育酚。

维生素E的测定方法有分光光度法、荧光法、薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法等。高效液相色谱法具有简便、快速、分辨率高等优点，可在短时间内完成同系物的分离测定，并可以同时测定维生素A和维生素E。

1.原理

样品经皂化处理后，用有机溶剂提取其中的维生素A和维生素E，用高效液相色谱法C18反相色谱柱将维生素A和维生素E分离，经紫外检测器检测，以保留时间定性，内标法定量。

本方法最小检出量分别为：维生素A0.8ng；α-生育酚：91.8ng；y-生育酚36.6ng；δ-生育酚20.6ng。

2.样品处理

（1）皂化。准确称取一定量的样品（含维生素A约3μg，维生素E各异构体约40μg）于皂化瓶中，加入氢氧化钾-乙醇溶液，沸水浴中回流30min，使皂化完全。维生素A和维生素E容易被氧化，皂化处理过程中需加抗氧化剂（如抗坏血酸）保护。同时加入一定量的内标物苯并α芘。

（2）提取。将皂化后的样品移入分液漏斗中，加入乙醚分次提取，弃水层。

（3）洗涤。用水洗涤乙醚层，用pH试纸检验直至水层不呈碱性。

（4）浓缩。将乙醚提取液经过无水硫酸钠脱水后，于55℃水浴中减压蒸馏，浓缩至约2mL乙醚时，立即用氮气吹干乙醚并加入2.00mL乙醇，溶解提取物。离心，上清液供色谱分析用。

3.测定方法

色谱参考条件为预柱：ODS，4.5cm×4mm，10μm；分析柱：ODS柱，25cm×4.6mm，5μm；流动相：甲醇∶水=98∶2；检测波长为300nm；进样量为20μL；流速为1.7mLmin。用标准溶液色谱峰的保留时间定性，根据标准和样品中待测维生素峰面积与内标物峰面积的比值，计算其含量。

4.方法说明

维生素A和E的标准溶液临用前需用紫外分光光度法标定其准确浓度。本方法不能将β-生育酚与γ-生育酚分开。

（三）β-胡萝卜素的测定

胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素，有多种异构体和衍生物，包括α、β、γ-胡萝卜素，玉米黄素，还包括叶黄素、番茄红素，总称为类胡萝卜素。其中α、β、γ-胡萝卜素，玉米黄素在分子结构中含有β-紫罗宁残基，在肝脏、小肠黏膜或其他组织中可转变为维生素A，故称为维生素A原。在类胡萝卜素中，以β-胡萝卜素效价最高，每1mg β-胡萝卜素约相当于167μg（或560IU）维生素A。在胡萝卜素酶的作用下，1molβ-胡萝卜素可以转化成2mol维生素A，但由于β-胡萝卜素的吸收率低，就生理活性而言，6μgβ-胡萝卜素才相当于1μg维生素A，故测得β-胡萝卜素含量除6才等于维生素A含量。

胡萝卜素天然存在于植物性食品中，为着色而添加胡萝卜素的食品也含有胡萝卜素。胡萝卜素对热、酸和碱比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促进其被氧化破坏。因其也属于脂溶性维生素，故可用有机溶剂从食物中提取。

胡萝卜素本身是一种色素，在450nm处有最大吸收，因此只要能与样品中的其他成分完全分离，便可定性和定量分析。在植物中β-胡萝卜素经常与叶绿素、叶黄素等共存，提取时这些色素也可能被有机溶剂同时提取，因此在测定前，必须将β-胡萝卜素与色素分离。常用的测定方法有柱色谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法及纸色谱法等，国家标准方法规定食品中胡萝卜素的测定方法为后两种。

1.高效液相色谱法

（1）原理。样品中的β-胡萝卜素，用丙酮和石油醚（20∶80）混合液提取，经三氧化二铝柱纯化，采用高效液相色谱法，以C18柱分离，紫外检测器检测，以保留时间定性，峰面积定量。(www.xing528.com)

本方法最低检出限为5.0mg/kg，线性范围为0～100mg/kg。

（2）样品处理。

①提取。称取或吸取一定量的样品，加入石油醚+丙酮（80∶20）反复提取，直至提取液无色，合并提取液，于旋转蒸发器上蒸发至干（水浴温度为30℃～40℃）。

②纯化。样品提取液用少量石油醚溶解，通过三氧化二铝层析柱分离。先用丙酮+石油醚（5∶95）洗脱液淋洗层析柱，然后再加入样品提取液，用丙酮+石油醚（5∶95）洗脱β-胡萝卜素。洗脱流速控制为20滴/min，收集于10mL容量瓶中，用洗脱液定容至刻度，样液用0.45μm微孔滤膜过滤，待测定。

③测定方法。色谱参考条件为C18柱：4.6mm×15cm；流动相：甲醇∶乙腈=90∶10；紫外检测器波长为448nm；流速为1.2mL/min。

（3）方法说明。

①层析柱中所装的三氧化二铝（100～120目）需预先于140℃活化2h，取出放入干燥器备用（层析柱为4cm×1.5cm）。

②配制β-胡萝卜素的标准溶液时，准确称量的标准品先用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解并洗涤烧杯数次，用石油醚定容。

2.纸色谱法

（1）原理。样品经过皂化后，用石油醚提取食品中的胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂进行纸色谱分离。由于胡萝卜素极性小，移动速度快，与其他色素分离，剪下含胡萝卜素的区带。洗脱后于450nm波长下测定吸光度值。本方法最低检出限为0.11μg，线性范围为1～20ng。

（2）样品处理。

①皂化。取适量样品（含胡萝卜素20～80＞g），加乙醇一氢氧化钾溶液，回流加热30min，然后用冰水使之迅速冷却。用石油醚提取，直至提取液无色。

②洗涤。将样品提取液用水洗涤到中性，用无水硫酸钠脱水。

③浓缩。洗涤后的提取液于60℃水浴蒸发至约1mL，用氮气吹干，立即加入2.00mL石油醚定容，供层析用。

（3）测定方法。在18cm×30cm的滤纸上点样，于石油醚饱和的层析缸中展开，待胡萝卜素与其他色素完全分开后，取出滤纸，待石油醚自然挥发干，将Rf值与胡萝卜素标准相同的层析带剪下，立即放入盛有石油醚的具塞试管中，振摇，使胡萝卜素完全溶入试剂中。以石油醚调零点，于450nm波长下测定吸光度值，与标准系列比较定量。

（4）方法说明。操作需在避光条件下进行。乙醇使用前需经脱醛处理。如果标准品不能完全溶解于有机溶剂中，必要时应先将标准品皂化，再用有机溶剂提取，经洗涤、浓缩、定容。

（四）维生素K的测定

维生素K又称抗出血维生素，是一类2-甲基-1，4-萘醌的衍生物。叶绿醌（维生素K1）存在于植物组织中，在菠菜、甘蓝、花椰菜和卷心菜等绿色蔬菜中含量较多。

维生素K的分析方法有紫外分光光度法、气相色谱法和高效液相色谱法等。目前测定绿色蔬菜中维生素K1的常用方法是高效液相色谱法。

1.原理

蔬菜中的维生素K1经石油醚提取后，用氧化铝色谱柱净化，除去干扰物。收集含维生素K1的淋洗液，浓缩定容后用高效液相色谱C18柱分离，用紫外检测器，在248nm处测定，以外标法计算试样中维生素K1的含量。

本方法检出限为0.5μg，线性范围为1～100μg/mL。

2.样品处理

（1）样品提取。准确称取一定量样品（维生素K1含量不低于2pg），加入丙酮，振摇提取。将上清液分别加入丙酮和石油醚多次萃取，萃取液于80℃水中蒸发至约1mL，用氮气吹干后，用石油醚溶解定容，供柱色谱分析用。

（2）净化。将提取液加入氧化铝柱中，先用石油醚洗涤，后用洗脱液（石油醚∶乙醚=97∶3）洗脱。浓缩、吹干后用正己烷定容，上清液供色谱分析。

3.测定方法

色谱参考条件为预柱：ODS，4.5cm×4mm，10μm；分析柱：ODS柱，25cm×4.6mm，5μm；流动相：甲醇∶正己烷=98∶2；紫外检测器波长为248nm；进样量为20μL；流速为1.5mL/min。

4.方法说明

（1）柱色谱用中性氧化铝需经磷酸盐处理、碱活化并检验柱效后，方可使用。洗脱时，流速为每秒1滴。

（2）维生素K易分解，紫外线照射会加速分解。因此，提取样品中的维生素K不采用皂化法，而是用有机溶剂直接提取。一般植物样品经干燥后，将其置于有机溶剂如乙醚、丙酮、石油醚中剧烈振摇，把维生素K提取出来。动物组织样品要预先干燥，再用有机溶剂提取。整个测定过程应避免强光的照射。