水溶性维生素的检测方法详解

（一）概述

水溶性维生素广泛存在于动植物组织中，所以饮食来源比较充足。但是由于它们的水溶性，体内多余量的水溶性维生素会从尿中排出。因此，为了满足人体生理、生化的需求，必须经常从食物中摄取。

水溶性维生素都易溶于水，不溶于苯、乙醚、三氯甲烷等大多数有机溶剂，在酸性介质中很稳定，加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易分解，特别在加热情况下，可大部分或全部被破坏，同时易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响。

根据水溶性维生素在食品中存在的形式（游离态或结合态），需分别采用不同的样品处理方法。水溶性维生素的分析方法通常有分光光度法、分子荧光法、高效液相色谱法和微生物法等。分光光度法和分子荧光法的样品前处理一般较复杂，且干扰物质多，测定误差较大，而高效液相色谱法测定水溶性维生素，样品前处理简单，样品用量少，分离速度快，可同时分析多种水溶性维生素。

（二）维生素C的测定

维生素C（抗坏血酸）是一种较强的还原剂，水溶液呈酸性。在酸性条件下，维生素C较稳定，在中性和碱性条件下不稳定，加热容易破坏。维生素C对氧敏感，氧化后的产物称为脱氢型抗坏血酸，仍然具有生理活性，当进一步水解为2，3-二酮古洛糖酸后，便失去生理功能。在食品中维生素C以这三种形式存在，但主要是前两者，故许多国家的食品成分表均以抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量表示维生素C的含量。

测定维生素C常用的方法有2，6-二氯靛酚滴定法、苯肼分光光度法、荧光法和高效液相色谱法等。采用2，6-二氯靛酚滴定法可以测定还原型抗坏血酸的含量，用荧光法和苯肼分光光度法则是测定总抗坏血酸的含量。

1.还原型抗坏血酸的测定

（1）原理。还原型抗坏血酸分子中有烯二醇结构，因而具有较强的还原性，在中性或弱酸性条件下能还原2，6-二氯靛酚染料，而本身被氧化成脱氢抗坏血酸。2，6-二氯靛酚染料在中性或碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色，被还原后颜色消失。滴定时，还原型抗坏血酸将2，6-二氯靛酚还原为无色，终点时，稍过量的2，6-二氯靛酚使溶液呈现微红色。

（2）测定方法。水果和蔬菜样品经捣碎混匀后，用偏磷酸乙酸提取，过滤或离心后，上清液供测定用。滴定前，配制的2，6-二氯靛酚溶液要用已知浓度的抗坏血酸标准溶液标定；滴定时，用已标定的2，6-二氯靛酚溶液滴定样品的上清液至微红色，并在15s内不消失，即为终点。同时做空白平行测定。根据滴定时所使用的已标定的2，6-二氯靛酚溶液的容积，可计算样品中还原型抗坏血酸的含量。

2.总抗坏血酸的测定

（1）荧光法。样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸后，与邻苯二胺（OPDA）反应生成有荧光的喹喔啉衍生物，其荧光强度与抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。硼酸与脱氢抗坏血酸结合生成硼酸脱氢抗坏血酸配合物，而不与邻苯二胺反应生成荧光物质，因此可以消除试样中荧光杂质产生的干扰。本方法检出限为0.022μg/mL，线性范围为5～20μg/mL。

称取一定量新鲜样品，加偏磷酸-乙酸溶液，匀浆，用百里酚蓝指示剂调节酸度（pH为1.2），过滤，滤液备用。分别取滤液及标准使用液，加适量活性炭，振摇过滤，分别收集滤液，即为试样氧化液和标准氧化液。各取一份试样氧化液和标准氧化液作为空白对照，分别加入硼酸-乙酸钠溶液，混合摇动，在4℃冰箱中放置2～3h。再分别取试样氧化液和标准氧化液各一份，加入乙酸钠溶液，备用。

取上述溶液于暗室中迅速加入邻苯二胺溶液，混合后在室温下反应35min，于激发光波长338nm、发射光波长420nm处测定荧光强度。用抗坏血酸含量为横坐标，对应的标准液的荧光强度减去标准空白荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线并计算样品中抗坏血酸含量。

方法说明：①邻苯二胺溶液在空气中颜色变暗，影响显色，应临用前配制。②活性炭对抗坏血酸的氧化作用，是基于其表面吸附的氧进行界面反应，加入量过少，氧化不充分，定量结果偏低；加入量过多，对抗坏血酸有吸附作用，使结果也偏低。③影响荧光强度的因素很多，各次测定条件很难完全再现，因此，标准曲线最好与样品同时做。④样品提取液中抗坏血酸浓度为1mg/mL左右，应根据此浓度酌情取样。⑤当食物中含有丙酮酸时，可与邻苯二胺反应生成一种荧光物质，干扰测定，可加入硼酸，而硼酸与脱氢抗坏血酸结合不与丙酮酸反应，以此消除样品中丙酮酸产生的荧光干扰。

（2）2，4-二硝基苯肼分光光度法。样品中维生素C用草酸提取，加入活性炭使提取液中还原型抗坏血酸氧化成为脱氢抗坏血酸，再与2，4-二硝基苯肼作用生成红色的脎；在85%硫酸溶液的脱水作用下，可转变为橘红色的无水化合物，在硫酸溶液中显色稳定，其吸光度值与总抗坏血酸的总量成正比，在最大吸收波长520nm处比色定量。本法操作简便、不需特殊仪器，适用于各种食品。

（三）维生素B1（硫胺素）的测定

维生素B1又称硫胺素、抗神经炎素。人体每日需要量为1～2mg。它参与糖代谢及乙酰胆碱的代谢，维持胆碱能神经的正常传导，促进消化功能。维生素B1缺乏可引起神经系统病变，表现为神经衰弱，如全身无力、焦虑不安、记忆力减退、食欲缺乏等，严重的可出现中枢神经系统内某些神经核退化，周围神经运动纤维变性，影响神经系统正常功能，引起多发性周围神经炎，维生素B1缺乏还可引起心血管系统病变。

硫胺素是由嘧啶环和噻唑环通过亚甲基相连而成的一类化合物，各种结构的硫胺素均具有维生素B1的活性。维生素B1易溶于水和正丁醇、异丁醇、异戊醇等有机溶剂，所以样品处理时可用正丁醇萃取。

食品中维生素B1的测定方法主要有硫色素荧光法、高效液相色谱法、荧光分光光度法等。荧光分光光度法的灵敏度和准确度较差，适用于测定维生素B1含量较高的食品样品；硫色素荧光法与高效液相色谱法适用于食品中微量维生素B1的测定。国家标准分析方法为荧光分光光度法。

1.原理

硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成硫色素，硫色素在紫外线照射下，发出荧光。在一定的条件下，其荧光强度与硫色素浓度成正比，即与溶液中硫胺素含量成正比。如样品中所含杂质过多，应经过离子交换剂处理，使之与硫胺素分离，测定样液中硫色素的荧光强度，与标准比较定量。

本方法检出限为0.05μg，线性范围为0.2～10.0μg。

2.样品处理

样品采集后，粉碎或匀浆于低温冰箱中保存，测定前解冻。

（1）提取。准确称取一定量的样品（约含硫胺素10～30pg），加稀盐酸溶解，在高压锅（121℃）中加热水解，加淀粉酶和蛋白酶于45℃～50℃酶解过夜，过滤得到提取液。

（2）净化。将提取液加入人造浮石交换柱中，硫胺素被吸附，用热蒸馏水冲洗交换柱，洗去杂质，再加入热的酸性氯化钾洗脱硫胺素，收集滤液。

（3）氧化。分别取两份上述净化液，在避光条件下分别加入氢氧化钠溶液和碱性铁氰化钾溶液，振摇后加入正丁醇，振摇，静置分层，弃下层碱性溶液。有机相加无水硫酸钠脱水。取两份标准溶液与样品同样操作，同时作为样品和试剂空白。

3.测定方法

荧光测定条件：激发波长365nm；发射波长435nm。依次测定样品空白和标准空白的荧光强度，样品和标准溶液的荧光强度，根据硫色素的荧光强度，计算样品中硫胺素的含量。

4.方法说明

（1）一般样品中的维生素B1有游离型的，也有结合型的，所以需进行酸水解和酶水解反应，使结合型的维生素B1成为游离型的，然后测定。

（2）紫外线会破坏硫色素，因此硫色素形成后要迅速测定，尽量避光操作。

（3）取两份净化液，一份加入氢氧化钠溶液破坏硫胺素，另一份加入碱性铁氰化钾溶液将硫胺素氧化成硫色素，生成的黄色至少应保持15s，否则应补加1～2滴，碱性铁氰化钾溶液用量不够，硫胺素氧化不完全，测定结果偏低，但碱性铁氰化钾溶液过量又会破坏硫色素。氧化是测定的关键步骤，操作中应保持加入试剂的速度一致。(www.xing528.com)

（四）维生素B2的测定

维生素B2即核黄素，呈黄色，由核糖醇和二甲基异咯嗪两部分组成。维生素B2易溶于水，在中性或酸性溶液中稳定，但在碱性溶液中较易分解。游离核黄素对光敏感，易被光线破坏。核黄素在中性或酸性溶液中经光照射可产生黄绿色荧光，因此测定核黄素常用荧光法。维生素B2的定量方法主要有：荧光分析法、分光光度法和高效液相色谱法；生物学定量法有微生物法、酶法和动物实验法。

1.原理

核黄素在440～500nm波长光照射下产生黄绿色荧光，在稀溶液中其荧光的强度与核黄素的浓度成正比，在525nm发射波长处测定其荧光强度；同时在样品液中加入连二亚硫酸钠，将核黄素还原成无荧光的物质，再测定溶液中荧光杂质的荧光强度，两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。

本方法检出限为0.006μg，线性范围为0.1～20.0μg。

2.样品处理

（1）提取。准确称取一定量的样品（含1.0～2.0μg核黄素），加入稀盐酸水解，再加淀粉酶或木瓜蛋白酶于37%～40%酶解约16h，过滤后得提取液。

（2）氧化去杂质。取一定量提取液及标准使用液（含1～10pg核黄素），加入高锰酸钾溶液，氧化去除杂质；加过氧化氢数滴，使高锰酸钾颜色褪去；剧烈振摇，使氧气逸出。

（3）吸附和洗脱。将氧化后的样液及标准溶液通过硅镁吸附柱后，用热水洗去杂质，用丙酮+冰乙酸+水（5∶2∶9）洗脱样品中的核黄素。

3.测定方法

于激发光波长440nm、发射光波长525nm处，测定样品管及标准管的荧光强度，并在各管的剩余液中加入连二亚硫酸钠溶液，立即混匀，在20s内测定样品还原前后的荧光强度，两值相差即为样品中核黄素的荧光强度。

4.方法说明

（1）核黄素暴露于可见光或紫外光中极不稳定，因此整个过程最好在避光条件下进行。

（2）核黄素可被连二亚硫酸钠还原为无荧光物质，但摇动后很快又被氧化成荧光物质，所以要立即测定。

（3）样品酸解后，加入一定量的淀粉酶或木瓜蛋白酶酶解，有利于结合型的核黄素转化。

（五）其他B族维生素的测定

1.维生素B6的测定

维生素B6指的是在性质上紧密相关，具有潜在维生素B6活性的三种天然存在的化合物：吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺。测定维生素B6的方法主要有微生物法、荧光分析法、气相色谱法和高效液相色谱法。

荧光分析法的原理是将样品经硫酸加压水解，采用CGS树脂的柱层析分离，以氯化钾的磷酸缓冲液洗脱。洗脱液在二氧化锰和乙醛酸钠溶液存在下，可使维生素B6的混合物即吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺都转化为吡哆醛。吡哆醛在氰化钾作用下生成强荧光物质——吡哆醛氰醇衍生物，在激发波长355nm、发射波长434nm处，测定其荧光强度，就可计算出样品中维生素B6的总量。

2.维生素B12的测定

维生素B12是具有氰钴胺素相似维生素活性的化合物的总称。维生素B12呈深红色，易溶于水和醇，受强碱、强酸和光照作用而分解。

测定维生素B12的方法主要有分光光度法、离子交换层析法和原子吸收分光光度法。维生素B12的分子中含有钴离子，占维生素B12的4.35%，采用原子吸收分光光度法可以测定其钴含量，再换算成维生素B12的含量。

原子吸收分光光度法原理：样品用维生素B12提取液（无水磷酸氢二钠1.3g+柠檬酸1.2g+无水焦亚硫酸钠1.0g加水至100mL）提取，滤液中加入EDTA，用氨水调pH至7，再加入活性炭，振摇，用定量滤纸过滤，维生素B12被吸附在活性炭上，在600℃下灰化，用稀硝酸将残渣溶解，以原子吸收分光光度法测定钴的含量。从钴换算为维生素B12的换算系数为22.99。

3.高效液相色谱法测定B族维生素

B族维生素的检测方法很多，如维生素B1可以采用荧光法，烟酸、烟酰胺采用分光光度法，维生素B6采用微生物法等。上述B族维生素的测定方法费时，多数是针对某个单一维生素进行的。高效液相色谱法分析速度快、灵敏度高、准确性好、样品量需用量少，可以同时测定多种B族维生素。下面简要介绍同时测定保健食品中的维生素B2、烟酸和烟酰胺的高效液相色谱法，该方法是国家卫生标准方法（GB/T 5009.197—2003）。

（1）实验原理。样品经甲醇、水和磷酸的混合液（100∶400∶0.5）提取，滤膜过滤后，以1-癸烷磺酸钠-乙腈-磷酸为流动相，用C18柱分离，紫外280nm检测，以保留时间定性，峰高或峰面积定量。

（2）样品处理。称取适量研磨混匀的样品，加入甲醇、水和磷酸的混合液（100∶400∶0.5）超声提取5min，3000r/min离心5min，上层清液经滤膜过滤后即可进样。

（3）色谱条件。C18柱（150mm×4.6mm，5μm），流速为1mL/min，柱温室温，检测波长为280nm。流动相为1-癸烷磺酸钠溶液（0.22g1-癸烷磺酸钠溶解于850mL水中）+乙腈+磷酸（850∶150∶1）。

（4）方法说明。

①可通过调节流动相的pH值来控制维生素的电离，从而调节其保留时间和分离度。流动相中加入0.1%磷酸，可降低维生素的离子化，改善峰形，减缓峰的拖尾现象。

②在检测多种B族维生素时，可以在测定过程中变换检测波长，以提高检测灵敏度，如维生素B1、烟酸、烟酰胺最大吸收波长为254nm，维生素B2、维生素B6、叶酸为280nm。

③由于B族维生素在水中可以解离为带电荷的离子，在流动相中加入一种与上述电荷相反的离子对试剂，使其形成中性离子对，即可于反相色谱中进行分离。B族维生素测定中主要选择烷基磺酸盐，可得到令人满意的分离效果。