凯氏定氮法测定蛋白质含量的方法及粗蛋白质概念解析

目前，测定蛋白质的方法分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量，肽链和折射率测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定蛋白质含量。最常用的方法是凯氏定氮法。此外，双缩脲分光光度比色法、染料结合分光光度比色法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定。近年来，国外采用红外检测仪，利用一定的波长范围内的近红外线具有被食品中蛋白质组分吸收和反射的特性，而建立了近红外光谱快速定量法。

对于不同的蛋白质，它的组成和结构不同，但从分析数据可以得到近似的蛋白质的元素组成百分比，C、H、O元素组成百分比依次为50%、7%和23%，而N、S、P元素组成的百分比则依次为16%、0～3%和0～3%。一般来说，蛋白质的平均含氮量为100/16，所以在用凯氏定氮法定量蛋白质时，将测得的总氮量乘上蛋白质的换算系数K=6.25即为该物质的蛋白质含量。但是我们必须要知道，当测定的样品其含氮的系数与上面100/16相差较大时，采用6.25将会引起显著的偏差。不同的蛋白质其氨基酸组成及方式不同，所以各种不同来源的蛋白质，其含N量也不相同，一般蛋白质含N量为16%，即1份N元素相当于6.25份蛋白质，此系数称为蛋白质换算系数。

1.凯氏定氮法

凯氏定氮法是目前普遍采用的测定有机N总量较为准确、方便的方法之一，适用于所有食品，所以国内外应用较为广泛。是经典的分析方法之一，也国家标准中的第一方法，该法由丹麦人道尔（J.Kieldahl）于1883年提出用于测定研究蛋白质而得名。凯氏定氮法是将蛋白质消化，测定其总N量，再换算成为蛋白质含量的方法。食品中的含N物质，除蛋白质外，还有少量的非蛋白质含N物质，所以该法测定的蛋白质含量应称为粗蛋白质。

凯氏定氮法有常量法、微量法及改良法，其原理基本相同，只是所使用的样品数量和仪器不同。而改良的常量法主要是催化剂的种类、硫酸和盐类添加量不同，一般采用硫酸铜、二氧化钛或硒、汞等物质代替硫酸铜。有些样品中含有难以分解的含N化合物，如蛋白质中含有色氨酸、赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、脯氨酸等，单纯以硫酸铜作为催化剂，18h或更长时间也难分解，单独用汞化合物，在短时间内即可，但它有毒性。下面主要介绍微量凯氏定氮法。

（1）原理：食品与硫酸和催化剂一起加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成CO2及H2O逸去，而氮以氨的形式与硫酸作用，形成硫酸铵留在酸液中。将消化液碱化、蒸馏，使氨游离，随水蒸气蒸出，被硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定所生成的硼酸铵，根据消耗的盐酸标准溶液的量，计算出总氮量。

（2）方法摘要：样品中的有机物和含N有机化合物，经浓H2SO4加热消化，H2SO4使有机物脱水，炭化为碳；碳将H2SO4还原为SO2，而本身则变为CO2；SO2使N还原为NH3，而本身则氧化为SO3，而消化过程中所生成的新生态氢，又加速了氨的形成。在反应中生成物CO2、H2O和SO2、SO3逸去，而NH3与H2SO4结合生成（NH4）2SO4留在消化液中。

蛋白质+H2SO4→C

C+H2SO4→SO2+CO2↑

SO2+［N］→NH3+SO3↑

NH3+H2SO4→（NH4）2SO4

浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水并炭化为碳、氢、氮。浓硫酸又有氧化性，使炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫：

二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。（NH4）2SO4在碱性条件下，加热蒸馏，释放出氨。

（NH4）2SO4+2NaOH=2NH3↑+Na2SO4+2H2O

蒸馏过程中所放出的NH3，可用一定量的标准硼酸溶液吸收，再用标准盐酸溶液直接滴定。

2NH3+4H3BO3=（NH4）2B4O7+5H20

（NH4）2B4O7+HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3

硼酸溶液仅呈极微弱的酸性，在此反应中并不影响所加的指示剂的变色反应，但具有吸收氨的作用，所以采用硼酸溶液作为吸收剂。

（3）主要试剂：所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。

硫酸（密度为1.8419g/L）；

硫酸钾；

硫酸铜（CuSO4·5H2O）；

硼酸溶液（20g/L）；

氢氧化钠溶液（400g/L）；

混合指示液：1份甲基红乙醇溶液（1/L）与5份溴甲酚绿乙醇溶液（1/L）临用时混合。也可用2份甲基红乙醇溶液（1/L）与1份亚甲基蓝乙醇溶液（1g/L）临用时混合。变色点pH=5.4，呈灰色；酸色为红紫色，碱色为绿色。

硫酸标准滴定溶液［c（1/2H2SO4）=0.0500moL/L］或盐酸标准滴定溶液［c（HCl）=0.0500mol/L］。

（4）分析步骤。

①试样处理准备。称取0.20～2.00g固体试样或2.00～5.00g半固体试样或吸取10.00～25.00mL液体试样（相当于氮30～40mg），移入干燥的100mL或500mL定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20mL硫酸，稍摇匀后于瓶口放一个小漏斗。注意：小心转移20mL浓硫酸，防止烧伤！

②消化。将准备好的凯氏烧瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。开始用微火小心加热（小心瓶内泡沫冲出而影响结果），待内容物全部炭化，泡沫完全停止，瓶内有白烟冒出后，升至中温，白烟散尽后升至高温，加强火力，并保持瓶内液体微沸（为加快消化速度，可分数次加入10mL 30%过氧化氢溶液，但必须将烧瓶冷却数分钟以后加入），经常转动烧瓶，观察瓶内溶液颜色的变化情况，当烧瓶内容物的颜色逐渐转变为澄清透明的蓝绿色后，继续消化0.5～1h（若凯氏烧瓶壁粘有碳化粒时，进行摇动或待瓶中内容物冷却数分钟后，用过氧化氢溶液冲下，继续消化至透明为止）。然后取下并使之冷却。提示：控制加热温度是关键！

③定容。向消化好并冷却至室温的试样消化液中小心加入20mL水，摇匀放冷，小心移入100mL容量瓶中，再用蒸馏水少量多次洗涤凯氏烧瓶，并将洗液一并转入容量瓶中，直至将烧瓶洗至中性，表明铵盐无损地移入容量瓶中，充分摇匀后，加水至刻度线定容，静置至室温，混匀备用。同样条件下做一试剂空白试验。注：在消化完全后，消化液应呈清澈透明的蓝绿色或深绿色（铁多），故CuSO4在消化中还起指示作用。同时应注意凯氏瓶内液体刚清澈时并不表示所有的N均已转化为氨，因此消化液仍要加热一段时间。

④蒸馏。按要求安装好定氮装置，保证管路密闭不漏气。在水气发生瓶内装水至2/3处，加甲基橙指示剂3滴及1～5mL硫酸，以保持水呈酸性［防止水中含有N，加硫酸使其以（NH4）2SO4形式固定下来，使其蒸馏中不会被蒸发］，开通电源加热至沸腾。打开进气口，关闭废液出口，接通冷凝水，空蒸5～10min，冲洗定氮仪、样杯、碱杯和内室。分别关闭进气口（注意不要同时关闭所有进气口），使废液自动倒吸于定氮仪外室，再由样杯加入少量水，再次冲洗，当废液全部吸入外室后，再放排液口，并使其敞开。在250mL锥形瓶中加入10mL（20g/L）硼酸溶液及1～2滴混合指示液，放置冷凝器的下端，并使冷凝管下端插入液面下。

准确吸取10mL试样处理液，由样杯加入定氮仪内室，并用10mL水冲洗样杯，但内室中溶液总体积不超过内室的2/3（约50mL），盖上棒状玻塞，加水至杯口1～2cm，以防漏气，关闭排队液口，迅速由碱杯加入10mL NaOH溶液（400g/L）（溶液应呈强碱性，注意内室颜色变化），通入蒸汽开始蒸馏。注：NaOH必须充分，即在反应中是过剩的，保证消化液中的硫酸铵完全转变为氨气，故Cu2SO4还可在碱蒸馏时作为碱性反应的指示剂，即CuSO4+2NaOH（要充分）→Cu（OH）2（棕褐色）+Na2SO4。

关闭排液口，蒸汽进入反应室（内室），使NH3通过冷凝管而进入接收瓶被硼酸吸收，蒸馏5min（蒸至液面达约150mL），移开接收瓶，使冷凝管下端离开液面，让玻璃管靠在锥形瓶的瓶壁，出液口在200mL刻度线以上，继续蒸馏1min，蒸至液位达200mL。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，将洗液一并聚集于硼酸溶液中，取下接收瓶。用蒸馏水冲洗冷凝管下端。注：蒸馏时要注意蒸馏情况，避免瓶中的液体发泡冲出，进入接受瓶。火力太弱，蒸馏瓶内压力减低，则接受瓶内液体会倒流，造成实验失败。

关闭进气口，停止送气，废液将自动倒吸入外室，待倒吸完全时，将样杯中的蒸馏水分数次放入，冲洗内室，待洗液全部吸入外室后，再打开排液口，放净废液。

按上述步骤，换下一个试样蒸馏，同时准确吸取10mL试剂空白消化液做空白实验。

⑤滴定。取下接收瓶，用0.05mol/L HCl标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。

（5）结果计算：试样中蛋白质的含量按下式进行计算。

式中：X——样品中蛋白质的含量，g/100g或g/100mL；

V1——样品消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL；

V2——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL；

c——硫酸或盐酸标准滴定溶液的浓度，mol/L；

0.0140——1.0mL盐酸［c（HCl）=1.000mol/L］或硫酸［c（1/2H2SO4）=1.000mol/L］或标准滴定溶液相当的氮的质量，g；

m——样品的质量或体积，g或mL；(www.xing528.com)

F——氮换算为蛋白质的系数。乳粉为6.38，纯谷物类（配方）食品为5.90，含乳婴幼儿谷物（配方）食品为6.25，大豆及其制品为5.71。

计算结果保留三位有效数字。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

（6）注意事项。

加入样品及试剂时，避免黏附在瓶颈上。

加入硫酸钾的作用：提高硫酸的沸点（338℃），增进反应速度。在消化过程中温度起着重要的作用，消化温度一般控制在360℃～410℃，低于360℃，消化不易完全，特别是杂环氮化物，不易分解，使结果偏低，高于410℃则容易引氮的损失。而H2SO4的沸点仅为330℃，K2SO4的沸点为400℃，10g硫酸钾将沸点提高至接近400℃，在消化过程中，随着H2SO4的不断分解，水分不断蒸发，K2SO4浓度逐渐升高，则沸点升高，加速对有机物的分解作用。但过多的硫酸钾会造成沸点太高，生成的硫酸氢铵在513℃会分解。

消化中若H2SO4消耗过多，则会影响盐的浓度，一般在凯氏瓶口插一个小漏斗，以减少H2SO4的损失。

消化中加入硫酸铜作为催化剂，加速氧化作用。凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多，除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉等，但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜，使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物的氧化分解，硫酸铜的作用机理如下所示：

此反应不断进行，待有机物全部被消化完后，不再有硫酸亚铜（Cu2SO4褐色）生成，溶液呈现清澈的二价铜的蓝绿色。故硫酸铜除起催化剂的作用外，还可指示消化终点，以及下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。

2.改良的凯氏定氮法——比色法

（1）原理：蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后在pH=4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中，铵与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3，5-二乙酰-2，6-二甲基-1，4-二氢化吡啶化合物，在波长400nm处测定吸光度，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。

（2）试剂。

硫酸铜。

硫酸钾。

硫酸。

氢氧化钠溶液（300g/L）：称取30g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100mL。

对硝基苯酚指示剂溶液（1g/L）：称取0.1g对硝基苯酚指示剂溶于20mL 95%乙醇中，加水稀释至100mL。

乙酸溶液（1mol/L）：量取5.8mL冰乙酸，加水稀释至100mL。

乙酸钠溶液（1mol/L）：称取41g无水乙酸钠或68g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），加水溶解后稀释至500mL。

乙酸钠-乙酸缓冲溶液：量取60mL乙酸钠溶液（1mol/L）与40mL乙酸溶液（1mol/L）混合，该溶液为pH=4.8。

显示剂：15mL 37%甲醛与7.8mL乙酰丙酮混合，加水稀释至100mL，剧烈振摇，混匀（室温下放置3日）。

氨氮标准储备溶液（1.0g/L）：精密称取105℃干燥2h的硫酸铵0.4720g，加水溶解后移入100mL容量瓶中，并稀释至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于1.0mg NH3-N（10℃下冰箱内储存稳定1年以上）。

氨氮标准使用溶液（0.1g/L）：用移液管精密吸取10mL氨氮标准储备液（1.0mg/mL）于100mL容量瓶内，加水稀释至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于100μg NH3-N（10℃下冰箱内贮存稳定1个月）。

（3）仪器：分光光度计；电热恒温水浴锅（100±0.5）℃；10mL具塞玻璃比色管。

（4）分析步骤。

①试样消解：精密称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样0.1～0.5g或半固体试样0.2～1.0g或吸取液体试样1～5mL，移入干燥的100mL或250mL定氮瓶中，加0.1g硫酸铜、1g硫酸钾及5mL硫酸，摇匀后于瓶口放一个小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。取下放冷小心加20mL水，放冷后移入50mL或100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理试样相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。

②试样溶液的制备：精密吸取2～5mL试样或试剂空白消化液于50～100mL容量瓶内，加1～2滴对硝基酚指示剂溶液（1g/L），摇匀后滴加氢氧化钠溶液（300g/L）中和至黄色，再滴加乙酸（1mol/L）至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。

③标准曲线的绘制：精密吸取0、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL氨氮标准使用溶液（相当于NH3-N 0、5.0μg、10.0μg、20.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg、100.0μg），分别置于10mL比色管中。向各比色管分别加入4mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH=4.8）及4mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀。置于100%水浴中加热15min。取出用水冷却至室温后，移入1cm比色皿内，以零管为参比，于波长400nm处测量吸光度，根据标准各点吸光度绘制标准曲线或计算直线回归方程。

④试样测定：精密吸取0.5～2.0mL（约相当于氮小于100μg）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于10mL比色管中。其余步骤同上。试样吸光度与标准曲线比较定量或代入标准回归方程求出含量。

（5）计算结果：试样中蛋白质的含量按下式进行计算。

式中：X——试样中蛋白质的含量，g/100g或g/100mL；

c——试样测定液中氮的含量，μg；

c0——试剂空白测定液中氮的含量，μg；

V1——试样消化液定容体积，mL；

V2——制备试样溶液的消化液体积，mL；

V3——试样溶液总体积，mL；

V4——测定用试样溶液体积，mL；

m——试样质量或体积，g或mL；

F——氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中的氮含量一般为15%～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为5.30。

精密度要求在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。

原理同凯氏定氮法。称取一定量的样品于消化管中，加一粒凯氏片于消化管中，然后加入5mL浓硫酸，放置过夜，同时做好样品空白管。在消化过程中，要先用低温消化，以防止高温消化时样品溢出，低温消化1h后，将温度升到最高档，至消化液无色透明。待消化液冷却后，加入少量的水冲洗消化管内壁并振荡，直至液体无色。放至室温后，加水至一定体积，作为样品溶液和试剂空白溶液，待测。

开启自动分析仪电源，输入测定时的参数，使产生蒸汽，同时调节蒸汽表，使蒸汽表的指针指到Normal。最后将消化管装入，关闭安全门后，开始自动定氮。当循环结束灯亮时，记录滴定结果，打开安全门，进行下一个样品测定。此仪器消耗盐酸溶液的最佳用量范围在0.5～7mL。