生物碱含量分析技术

生物碱的定量分析方法大多是根据其含有的氮原子或双键或分子中官能团的理化性质而设计的。早期常用酸碱滴定法、比色法、沉淀法等化学方法，近年来更多采用薄层色谱法、气相色谱法以及高效液相色谱法、毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE）等。

1.紫外分光光度法

生物碱分子结构中大都含有共轭双键或芳香环，在紫外区域有特征吸收。由于取代基团和测定时所用溶剂不同，以及受整个分子结构的影响，其特征吸收波长会有所改变。当被测样品中无干扰成分时，可通过直接测定生物碱在最大吸收波长处的吸光值来计算含量。紫外分光光度法的优点在于操作简便、快速，样品用量少，专属性强，准确度高。缺点是抗干扰能力差，样品测定前一般要经萃取法或色谱法进行处理。

2.比色法

通过加入适当的显色剂与生物碱反应之后，在可见光区测定其最大吸收波长处的吸光值，计算出含量，这种分析方法叫比色法。该方法的灵敏度高，所需样品量少，并且有一定的专属性和准确性，是生物碱类成分重要的分析方法之一。

比色法测定生物碱通常包括：①加酸性染料（如溴麝香草酚蓝、溴甲酚绿等）比色法；②与生物碱沉淀剂（如苦味酸盐、雷氏盐等）反应产生有色沉淀，定量分离溶解后再进行比色；③根据生物碱自身的性质或分子中所含官能团，与某些试剂发生显色反应，再进行比色，如异羟肟酸铁比色法。

（1）酸性染料比色法。

在一定pH条件下，某些生物碱类成分能与H+结合成阳离子，而酸性染料在此条件下解离为阴离子，两者可定量结合成有色离子对，再以有机溶剂定量提取，测定一定波长下提取液的吸光值或经碱化后释放的染料的吸光值，即可计算出生物碱的含量。此方法测定的关键在于，介质的pH值、酸性染料的种类和有机溶剂的选择，其中尤以pH的选择更为重要。

（2）雷氏盐比色法。

雷氏盐又称雷氏铵盐或硫氰酸铬铵，其组成为NH4［Cr（NH3）2（SCN）4］·H2O，为红色至深红色结晶，微溶于冷水，易溶于热水，可溶于乙醇。在酸性水溶液或酸性稀醇中，雷氏铵盐可与生物碱类成分定量反应生成难溶于水的红色络合物。含2个或2个以上氮原子的生物碱，则可与雷氏铵盐进一步作用生成双盐、三盐等沉淀。生物碱雷氏盐沉淀易溶于丙酮，其丙酮溶液所呈现的吸收特征是来自于分子结构中硫氰酸铬铵部分，而不是结合的生物碱部分。测定时，可将此沉淀过滤洗净后溶于丙酮（或甲醇），于525 nm（溶于甲醇时，427 nm）处直接比色测定，再换算成生物碱含量；或者，精密加入过量雷氏盐，滤除生成的生物碱雷氏盐沉淀，测定滤液中残存的过量雷氏盐含量，从而间接计算出生物碱含量。

应用雷氏盐法进行比色测定时应注意：①雷氏盐的水溶液在室温下可分解，使用时应新鲜配制，沉淀反应也需在低温下进行；②雷氏盐的丙酮或丙酮-水溶液的吸光值随时间而变化，应快速测定。

（3）苦味酸盐比色法。

在弱酸性或中性溶液中，生物碱可与苦味酸定量生成苦味酸盐沉淀，该沉淀可溶于氯仿等有机溶剂，在碱性条件下则可解离释放出苦味酸和生物碱。在含量测定时可采用三种方法：①在pH4～5的缓冲溶液中加氯仿溶解生物碱苦味酸盐后，在360 nm处直接比色；②在pH 7条件下使生物碱生成苦味酸盐沉淀，用氯仿溶解提取，再用pH 11的缓冲溶液将其解离，将苦味酸转溶到碱性水溶液中进行比色；③滤出生物碱苦味酸盐沉淀，加碱使其解离，以有机溶剂萃取游离出的生物碱，将含苦味酸的碱性水溶液进行比色测定。(www.xing528.com)

（4）异羟肟酸铁比色法。

含有酯键的生物碱，在碱性介质中加热使酯键水解，产生的羧基与盐酸羟胺反应生成异羟肟酸，再与Fe3+反应生成紫红色的异羟肟酸铁，在530 nm处有最大吸收。由于含有酯键结构（包括内酯）的成分均能发生上述反应，因此测定的样品溶液中必须不存在其他酯类成分，以免影响分析结果。

3.薄层色谱法

薄层色谱法测定生物碱类成分的优点在于操作简单而快速，在选用的条件下能对不同的组分有较好的分离，抗干扰能力较强。但是，如果样品成分太复杂，且含量很低，则在层析之前应进行纯化处理。常用的定量方法有薄层色谱——分光光度法和薄层色谱扫描法，其中后者多采用双波长反射式锯齿扫描，若被测成分本身具有荧光，也可采用荧光扫描。

4.高效液相色谱法

高效液相色谱法是生物碱类成分定量分析最常用的方法，尤其适用于单体生物碱成分的含量测定。由于生物碱类化合物种类繁多、酸碱性强弱不同、存在形式不同，采用高效液相色谱法进行含量测定时，必须全面考虑各种因素，包括固定相、流动相、检测方法及样品前处理等，可选用的方法包括吸附色谱、正相色谱、反相色谱及离子交换色谱法等，其中以反相色谱法最为常用。

在反相色谱法中，多采用非极性化学键合固定相，如十八烷基硅烷键合硅胶（简称ODS或C18）、辛烷基硅烷键合硅胶（C8）；流动相常用甲醇-水、乙腈-水系统。

5.气相色谱法

气相色谱法测定生物碱含量，只适用于有挥发性且热稳定的生物碱类成分，如麻黄碱、槟榔碱、苦参碱等。某些挥发性生物碱的盐类在约325℃急速加热下，变成游离生物碱，可直接进行气相色谱分析。但是必须注意，生物碱盐在急速加热器中产生的酸对色谱柱和检测器不利。样品溶液在提取、纯化过程中要避免加热，以防成分被破坏或挥发，最后需用氯仿等低极性有机溶剂来制备供试液。

6.毛细管电泳法

大多数生物碱分子结构中含有的氮原子呈碱性，在酸性环境下电离成阳离子，而具有不同的荷质比，可采用区带毛细管电泳法进行分离。分析时，可根据生物碱pKa值的不同选择缓冲液pH值，还可根据结构上的细微差异适当加入一些试剂以增强选择性和分离度。部分生物碱（如吲哚类生物碱）由于碱性较弱而较难电离，可选择胶束毛细管电泳法。但由于生物碱本身带正电荷，容易与管壁上的固定电荷（负电荷）发生作用，因此常需加入乙腈、甲醇等改性剂，以改善拖尾现象。