电泳技术的介绍与应用

1.纸电泳和乙酸纤维素薄膜电泳

纸电泳是用滤纸做支持介质的一种早期电泳技术。尽管分辨率比凝胶介质要差，但由于其操作简单，仍有很多应用，特别是在血清样品的临床检测和病毒分析等方面有重要用途。

纸电泳使用水平电泳槽。分离氨基酸和核苷酸时常用pH值为2～3.5的酸性缓冲液，分离蛋白质时常用碱性缓冲液。选用的滤纸必须厚度均匀，常用国产新华滤纸和进口的Whatman 1号滤纸。点样位置是在滤纸的一端距纸边5～10 cm处。样品可点成圆形或长条形，长条形的分离效果较好。点样量为5～100μg和5～10μL。点样方法有干点法和湿点法，湿点法是在点样前即将滤纸用缓冲液浸湿，样品液要求较浓，不宜多次点样；干点法是在点样后再用缓冲液和喷雾器将滤纸喷湿，点样时可用吹风机吹干后多次点样，因而可以用较稀的样品。电泳时要选择好正、负极，通常使用2～10V/cm的低压电泳，电泳时间较长。对于氨基酸和肽类等小分子物质，则要使用50～200 V/cm的高压电泳，电泳时间可以大大缩短，但必须解决电泳时的冷却问题，并要注意安全。

电泳完毕记下滤纸的有效使用长度，然后烘干，用显色剂显色，显色剂和显色方法可查阅有关书籍。定量测定的方法有洗脱法和光密度法。洗脱法是将确定的样品区带剪下，用适当的洗脱剂洗脱后进行比色或分光光度测定。光密度法是将染色后的干滤纸用光密度计直接定量测定各样品电泳区带的含量。

乙酸纤维素薄膜电泳与纸电泳相似，只是换用了乙酸纤维素薄膜作为支持介质。将纤维素的羟基乙酰化为乙酸酯，溶于丙酮后涂布成有均一细密微孔的薄膜，其厚度为0.1～0.15 mm。

乙酸纤维素薄膜电泳与纸电泳相比有以下优点：①乙酸纤维素薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后蛋白质区带更清晰。②快速省时，由于乙酸纤维素薄膜亲水性比滤纸小，吸水少，电渗作用小，电泳时大部分电流由样品传导，因此分离速度快，电泳时间短，完成全部电泳操作只需90 min左右。③灵敏度高，样品用量少。血清蛋白电泳仅需2 μL血清，点样量甚至少到0.1 μL，仅含5 μg的蛋白样品也可以得到清晰的电泳区带。临床医学用于检测微量异常蛋白的改变。④应用面广，可用于纸电泳不易分离的样品，如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋白等。⑤乙酸纤维素薄膜电泳染色后，用乙酸、乙醇混合液浸泡后可制成透明的干板，有利于光密度计和分光光度计扫描定量及长期保存。

由于乙酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、价廉，目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，为心血管疾病、肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据，因而已成为医学和临床检验的常规技术。

2.琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D-半乳糖和3，6脱水L-半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1%～3%（体积分数），加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度地取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。市售的琼脂糖有不同的提纯等级，主要以硫酸根的含量为指标，硫酸根的含量越少，提纯等级越高。

琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。例如，浓度为1%（体积分数）的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA分子、RNA分子的分离、分析，由于DNA分子、RNA分子通常较大，在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如，对于双链DNA，电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。另外，一些低熔点的琼脂糖（62℃～65℃）可以在65℃时熔化，因此其中的样品如DNA可以重新溶解到溶液中而回收。

由于琼脂糖凝胶的弹性较差，难以从小管中取出，一般不适合于管状电泳，管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式电泳应用得相对较少。

3.聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是以单体丙烯酰胺（Acr）和双体甲叉丙烯酰胺（Bis）为材料，在催化剂作用下，聚合为含酰胺基侧链的脂肪族长链，在相邻长链间通过甲叉桥连接而成的三维网状结构。其孔径大小是由Acr和Bis在凝胶中的总浓度T、Bis占总浓度的百分含量C及交联度决定的。交联度随着总浓度的增加而降低。一般而言，浓度越大及交联度越大，孔径越小。聚丙烯酰胺聚合反应需要有催化剂催化方能完成。常用的催化剂有化学催化剂和光化学催化剂。化学催化剂一般以过硫酸铵（AP）、四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂。当Acr、Bis和TEMED溶液中加入过硫酸铵时，过硫酸铵即产生自由基，丙烯酰胺与自由基作用后随即被“活化”，活化的丙烯酰胺在交联剂Bis存在下形成凝胶。聚合的初速度与过硫酸铵的浓度的平方根成正比。这种催化系统需要在碱性条件下进行，例如，在pH值为8.8条件下，7%的丙烯酰胺在30 min就能聚合完全，而在pH值为4.3时则需90 min才能完成。温度、氧分子、杂质都会影响聚合速度：在室温下通常能很快聚合，温度升高，聚合加快；有氧或杂质存在时则聚合速度降低。在聚合前，将溶液分别抽气，可消除上述影响。光聚合反应的催化剂是核黄素，光聚合过程是一个光激发的催化反应过程。在氧及紫外线作用下，核黄素生成含自由基的产物，自由基的作用与前述过硫酸铵相同。光聚合反应通常将反应混合液置于荧光灯旁，即可发生反应。用核黄素催化反应时，可不加TEMED，但加入后会使聚合速度加快，核黄素催化剂的优点是用量极少（1 mg/100 mL），对所分析样品无任何影响；聚合作用可以控制，改变光照时间和强度，可使催化作用延迟或加速。光聚合作用的缺点是凝胶呈乳白色，透明度较差。聚丙烯酰胺凝胶系统可分为连续和不连续电泳系统。连续系统是指电泳槽中的缓冲系统的pH与凝胶中的相同。不连续系统是指电泳槽中的缓冲系统的pH与凝胶中的不同。一般不连续系统的分辨率较高，因此目前生化实验室广泛采用不连续电泳。不连续电泳过程有三种效应，除一般电泳都具备的电荷效应外，还具有浓缩效应和分子筛效应。

（1）浓缩效应。

由于电泳基质的不连续，样品在浓缩层中得以浓缩，然后到达分离层得以分离。具体表现如下。

①凝胶层的不连续性。电泳凝胶分两层，上层是大孔径的样品胶和浓缩胶（凝胶浓度低），下层为小孔径的分离胶（凝胶浓度高）。蛋白质分子在大孔径胶中受到的阻力小，移动速度快。进入小孔径胶后受到的阻力大，移动速度减慢。

②缓冲液离子成分的不连续性。在缓冲体系中存在三种不同的离子：第一种离子在电场中具有较大的迁移率，在电泳中走在最前面，这种离子称为前导离子（leading ion）；第二种与前导离子带有相同的电荷，但迁移率较小的离子称为尾随离子（tracking ion）；第三种是和前两种带有相反电荷的离子，称为缓冲平衡离子（buffer counter ion）。前导离子只存在于凝胶中，尾随离子只存在于电极缓冲液中，而缓冲平衡离子则在凝胶和缓冲液中均有。例如，分离蛋白质样品时，氯离子（Cl-）为前导离子，甘氨酸离子（NH2CH2COO-）为尾随离子，三羟甲基氨基甲烷（Tris）为缓冲平衡离子。电泳开始后，在样品胶和电极缓冲液间的界面上，前导离子很快地离开尾随离子向下迁移，由于选择了适当的pH缓冲液，蛋白质样品的有效迁移率介于前导离子与尾随离子的界面处，从而被浓缩成为极窄的区带。

③电位梯度的不连续性。电位梯度的高低影响电泳速度，电泳开始后，由于前导离子的迁移率最大，在其后边就形成一个低离子浓度的区域即低电导区。电导与电位梯度成反比：

式中，E为电位梯度；I为电流强度；ke为电导率。这种低电导区就产生了较高的电位梯度，这种高电位梯度使蛋白质和尾随离子在前导离子后面加速移动，因而在高电位梯度和低电位梯度之间形成一个迅速移动的界面。由于样品的有效迁移率介于前导离子、尾随离子之间，因此也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩成一狭小的样品薄层。

④pH的不连续性。在样品胶和浓缩胶之间有pH的不连续性，这是为了控制尾随离子的解离，从而控制其迁移率，使尾随离子的迁移率较所有被分离样品的迁移率低，以使样品夹在前导离子和尾随离子之间而被浓缩。一般样品胶的pH值为8.3，浓缩胶的pH值为6.8。

（2）电荷效应。(www.xing528.com)

蛋白质混合物在界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一个狭小的高度浓缩的蛋白质区。但由于每种蛋白质分子所载有效电荷不同，故电泳速度也不同。这样各种蛋白质就以一定的顺序排列成一条一条的蛋白质区带。

（3）分子筛效应。

在浓缩层得到浓缩的蛋白质区带逐渐泳动到达分离层。由于分离层凝胶浓度大，网状结构的孔径小，蛋白质分子受到凝胶的阻滞作用。相对分子质量大且不规则的分子所受阻力大，泳动速度慢；相对分子质量小且形状为球形的分子所受阻力小，泳动速度快。这样，分子大小和形状不同的各组分在分离胶中得到分离。

（4）聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点。

①聚丙烯酰胺凝胶是人工合成的凝胶，可通过调节单体和交联剂的比例，形成不同程度的交联结构，容易得到孔径大小范围广泛的凝胶，所以实验重复性很高。

②凝胶机械强度好、弹性大，便于电泳后处理。

③聚丙烯酰胺凝胶是碳-碳的多聚体，只带有不活泼的侧链，没有其他离子基因，因而几乎没有电渗作用。另外，聚丙烯酰胺不与样品发生相互作用。

④在一定范围内，凝胶对热稳定、无色透明、易于操作及观察，可用检测仪直接分析。

⑤设备简单，所需样品量少，分辨率高。

⑥用途广泛。除可用于生物高分子化合物的分析鉴定外，也可用于毫克级水平的分离制各。

4.等电聚焦电泳

等电聚焦电泳是根据两性物质等电点（pI）的不同而进行分离的，它具有很高的分辨率，可以分辨出等电点相差0.01的蛋白质，是分离两性物质如蛋白质的一种理想方法。等电聚焦电泳的分离原理是在凝胶中通过加入两性电解质形成一个pH梯度，两性物质在电泳过程中会被集中在与其等电点相等的pH区域内，从而得到分离。两性电解质是人工合成的一种复杂的多氨基、多羧基的混合物。不同的两性电解质有不同的pH梯度范围，要根据待分离样品的情况选择适当的两性电解质，使待分离样品中各个组分都在两性电解质的pH范围内，两性电解质的pH范围越小，分辨率越高。

等电聚焦电泳多采用水平平板电泳，也使用管式电泳。由于两性电解质的价格昂贵，使用1～2 mm厚的凝胶进行等电聚焦电泳价格较高，使用两条很薄的胶带作为玻璃板间隔，可以形成厚度仅为0.15 mm的薄层凝胶，从而大大降低成本，因此，等电聚焦电泳通常使用这种薄层凝胶。由于等电聚焦过程需要蛋白质根据其电荷性质在电场中自由迁移，通常使用较低质量浓度的聚丙烯酰胺凝胶（如4%）以防止分子筛作用，也经常使用琼脂糖，尤其是对于相对分子质量很大的蛋白质。制作等电聚焦薄层凝胶时，首先将两性电解质、核黄素与丙烯酰胺储液混合，加入带有间隔胶条的玻璃板上，而后在上面加上另一块玻璃板，形成平板薄层凝胶。经过光照聚合后，将一块玻璃板撬开移去，将一小薄片湿滤纸分别置于凝胶两侧，连接凝胶和电极液（阳极为酸性，如磷酸溶液；阴极为碱性，如氢氧化钠溶液）。接通电源，两性电解质中不同等电点的物质通过电泳在凝胶中形成pH梯度，从阳极侧到阴极侧pH由低到高呈线性梯度分布。而后关闭电源，上样时取一小块滤纸吸附样品后放置在凝胶上，通电30 min后样品通过电泳离开滤纸加入凝胶中，这时可以去掉滤纸。最初样品中蛋白质所带的电荷取决于放置样品处凝胶的pH，等电点在pH以上的蛋白质带正电，在电场的作用下向阴极移动，在迁移过程中，蛋白质所处的凝胶的pH逐渐升高，蛋白质所带的正电荷逐渐减少，到达pH=pI处的凝胶区域时蛋白质不带电荷，停止迁移。同样，等电点在上样处凝胶pH以下的蛋白质带负电，向阳极移动，最终到达pH=pI处的凝胶区域停止。可见等电聚焦过程无论样品加在凝胶上的什么位置，各种蛋白质都能向着其等电点处移动并最终到达其等电点处，对最后的电泳结果没有影响。因此，有时样品可以在制胶前直接加入凝胶溶液中。使用较高的电压（如2000 V，0.5 mm平板凝胶）可以得到较快速的分离（0.5～1 h），但应注意对凝胶的冷却以及使用恒定功率的电源。凝胶结束后对蛋白质进行染色时应注意不能直接染色，要首先经过10%三氯乙酸的浸泡以除去两性电解质后才能进行染色。

等电聚焦电泳还可以用于测定某个未知蛋白质的等电点。将一系列已知等电点的标准蛋白（通常pI 3.5～10.0）及待测蛋白同时进行等电聚焦电泳，测定各个标准蛋白电泳区带到凝胶某一侧边缘的距离，对各自的pI作图，即得到标准曲线。再测定待测蛋白的距离，通过标准曲线即可求出其等电点。

5.毛细管电泳

1981年，Jorgenson等首先提出在75 μm内径的毛细管柱内用高压电进行分离，创造了毛细管电泳技术。毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）也称为高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE），是以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力而实现分离的新型液相分离技术。毛细管电泳自问世以来得到迅速发展，同时也促进了各种活性物质分析分离技术的发展，受到人们的重视。

CE所用的石英毛细管管壁的主要成分是硅酸（H2SiO3），在pH值＞3时，H2SiO3发生解离，使得管内壁带负电，和溶液接触形成双电层。在高电压作用下，双电层中的水合阳离子层使得溶液整体向负极定向移动，形成电渗流。带正电荷粒子所受的电场力和电渗流的方向一致，其移动速率是泳动速率和电渗流之和；不带电荷的中性粒子是在电渗的作用下移动的，其泳动速率为0，故移动速率相当于电渗流；带负电荷粒子所受的电场力和电渗流的方向相反，因电渗的作用一般大于电场力的作用，故其移动速率为电渗流与泳动速率之差。在毛细管中，不管各组分是否带电荷以及带何种电荷，它们都会在强大的电渗流的推动下向负极移动，但是移动速率不一样，正离子＞中性粒子＞负离子，这样样品中各组分就因为移动速率不同而得以分离。毛细管电泳和其他电泳的区别在于：无论是否带电，各种成分的物质都可以分离，在一般电泳中起破坏作用的电渗却是毛细管电泳的有效驱动力之一。

毛细管电泳的优点可概括如下：分辨率高，塔板数为105～106个/m，高者可达107个/m；灵敏度高，紫外检测器的检测限可达10-13～10-15 mol，激光诱导荧光检测器检测限可达10-19～10-21 mol；检测速度快，一般分析在十几分钟内完成，最快可在60 s内完成；样品用量极少，进样所需样品为纳升级；成本低，实验消耗只需几毫升流动相，维持费用很低；模式多，可根据需要选用不同的分离模式且仅需一台仪器；自动化程度高，CE是目前操作自动化程度最高的电泳技术。但是，由于CE样品用量少，不利于制备。

CE可以采用多种分离介质，具有多种分离模式和多种功能，因此其应用非常广泛。通常能配成溶液或悬浮溶液的样品（除挥发性和不溶物外）均能用CE进行分离和分析，小到无机离子，大到生物大分子和超分子，甚至整个细胞都可进行分离检测，如核酸（核苷酸）、蛋白质（多肽、氨基酸）、糖类（多糖、糖蛋白）、酶、微量元素、维生素、杀虫剂、染料、小的生物活性分子、红细胞、体液等都可以用CE进行分离分析。此外，CE在DNA序列和DNA合成中产物纯度测定、药物与细胞的相互作用和病毒的分析、碱性药物分子及其代谢产物分析、手性药物分析等方面都有重要应用。