柱层析技术的基本操作说明

1.装柱

装柱就是把经过适当预处理的基质（吸附剂、离子交换剂、凝胶等）装入层析柱；要求装填均匀，不能分层，不能有气泡或裂缝。装柱是柱层析中最基础最关键的一步。

首先依据基质类型和分离方法选择好粗细均匀、一定直径和高度的层析柱。一般柱子的直径与长度比为1∶10～1∶50；凝胶柱可选择1∶100～1∶200，并且将柱子洗涤干净待用。

基质在装入柱子前要进行适当的预处理。将层析用的基质在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸、碱、盐溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质。然后，用去离子水洗涤干净并真空抽气，以除去其内部的气泡。

装柱的方法有干法和湿法两种。干法装柱是将干燥的基质一边振荡一边慢慢倒入柱内，使之装填均匀，然后再慢慢加入适当的缓冲液。干法装柱要特别注意柱内是否存在气泡或裂缝，以免影响分离效果。湿法装柱是在柱内先装入一定体积的缓冲液，然后将处理好的基质溶液一边搅拌一边倒入保持垂直的层析柱内，让基质慢慢自然沉降，从而装填成均匀、无气泡、无裂缝的层析柱，最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有2～3 cm高的缓冲液，以免进入空气而影响分离效果。

2.平衡

平衡就是用3～5倍柱床（基质填充的高度称为柱床高度）体积的缓冲液（有一定的pH和离子强度）在恒定压力下冲洗柱子，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。

3.上柱

上柱就是将欲分离的样品混合液加入层析柱中。上柱量的多少直接影响分离的效果，可根据样品中被分离物质的浓度确定。一般情况下，上柱量尽量少些，分离效果比较好。通常上柱量应少于操作容量的20%，最大加样量必须在具体条件下多次试验后才能确定。应该注意的是，上柱时应缓慢小心地将样品加到固定相表面，尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦。(www.xing528.com)

4.洗脱

上柱完毕后，采用适当的洗脱剂和洗脱方式将各组分从层析柱中分别洗脱下来，以达到分离的目的。洗脱的方式可分为简单洗脱、阶段洗脱和梯度洗脱三种。

（1）简单洗脱。始终用同一种洗脱剂洗脱，凝胶层析多采用这种洗脱方式。如果各组分对固定相的亲和力差异不大，其区带的洗脱时间间隔也不长，采用这种方法较为适宜。但需要选择合适的溶剂，才能使各组分有效分离。

（2）阶段洗脱。采用洗脱能力不同的洗脱剂逐级进行洗脱，每次用一种洗脱剂将其中一种组分快速洗脱下来。当混合物组成简单、各组分对固定相的亲和力差异较大或者样品需快速分离时，采用这种洗脱方式比较合适。

（3）梯度洗脱。采用洗脱能力连续变化的洗脱剂进行洗脱，洗脱能力的变化可以是浓度、极性、离子强度或pH值等的递增或递减，因此叫梯度洗脱。当混合物组成复杂且各组分对固定相的亲和力差异较小时，宜采用梯度洗脱。

洗脱条件也是影响层析分离效果的重要因素。如果对分离混合物的性质不太了解，可以先采用线性梯度洗脱的方式进行尝试，但梯度的斜率要小一些，这样洗脱时间较长，对性质相近的组分分离比较有利。另外，洗脱速率对分离效果有显著影响。速度太快，各组分在固液两相中平衡时间短，性质相似的组分相互分不开；速度太慢，将增大物质在基质中的扩散，同样不能达到理想的分离效果。因此，要进行多次试验以得到合适的流速。此外，在整个洗脱过程中，千万不能使层析柱进气泡或干柱，否则会大大影响分离纯化的效果。

5.再生

洗脱完成后，采用适当的方法处理基质（吸附剂、离子交换剂、凝胶等）可恢复其性能，以便反复使用。不同基质再生的方法各异，具体可以参阅相关文献。