层析技术的基本概念

1.固定相和流动相

每个层析系统都包括两相，一个是固定相，另一个是流动相。

固定相是层析的一个基质，是在色谱分离中固定不动、对样品产生保留的一相。它可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用，它对层析分离的效果起着关键作用，有时甚至起着决定性作用。

在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或者超临界体等，都称为流动相。在柱层析中一般称为洗脱剂或洗涤剂，在薄层层析中称为展开剂，它也是层析分离中的重要影响因素之一。

2.分配系数和迁移率

分配系数是指在一定条件下，某一组分在固定相和流动相中作用达到平衡时，该组分分配到固定相与流动相中的含量（浓度）的比值，常用K来表示。

分配系数与被分离的物质本身及固定相和流动相的性质有关，同时受温度、压力等条件的影响。所以，不同物质在不同条件下的分配系数各不相同。当层析条件确定时，某一物质在此层析系统条件中的分配系数为一常数。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据，反映了被分离的物质在两相中的迁移能力及分离效能。在不同类型的色谱中，分配系数有不同的概念：吸附色谱中称为吸附系数，离子交换色谱中称为交换系数，凝胶色谱中称为渗透参数。

迁移率是指在一定条件下，相同时间内，某一组分在固定相移动的距离与流动相移动的距离的比值，常用Rf来表示，Rf≤1。

Rf值取决于被分离物质在两相间的分配系数及两相间的体积比。在同一实验条件下，两相体积比是一常数，所以Rf值取决于分配系数。不同物质的分配系数是不同的，Rf值也不相同。可以看出，K值越大，则该物质越趋向于分配到固定相中，Rf值就越小；反之，K值越小，则该物质越趋向于分配到流动相中，Rf值就越大。分配系数或Rf值的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。显然，差异越大，分离效果越理想。

3.分辨率

分辨率是指两个相邻峰的分开程度，用Rs表示。

式中，V1——组分1从进样点到对应洗脱峰之间的洗脱液体积；

V2——组分2从进样点到对应洗脱峰之间的洗脱液体积；(www.xing528.com)

W1——组分1的洗脱峰宽度；

W2——组分2的洗脱峰宽度；

Y——组分1和组分2洗脱峰处洗脱液体积之差。

两个峰尖之间距离越大，分辨率越高；两峰宽度越大，分辨率越低。Rs值越大表示两峰分得越开，两组分分离得越好。当Rs≤0.5时，两峰部分重叠，两组分不完全分离；当Rs=1时，两组分分离得较好，互相沾染约2%，即两种组分的纯度约为98%；当Rs=1.5时，两峰完全分开，称为基线分离，两组分基本完全分离，两种组分的纯度达到99.8%。

影响分辨率的因素是多方面的，被分离物质本身的理化性质、固定相和流动相的性质以及洗脱流速、进样量等因素都会影响层析分辨率。操作时应当根据实际情况综合考虑，特别是对于生物大分子，还必须考虑它的稳定性和活性等问题。还有诸如pH值、温度等条件都会对其产生较大的影响。

4.操作容量（交换容量）

在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，称为操作容量或交换容量。它的单位是mmol/g（mg/g）或mmol/mL（mg/mL），数值越大，表明基质对该物质的亲和力越强。应当注意，同一种基质对不同种类分子的操作容量是不相同的，这主要缘于分子大小（空间效应）、带电荷的多少、溶剂的性质等多种因素的影响。因此，在实际操作时，加入的样品量要控制在一定范围内，尽量少些，尤其是生物大分子，否则用层析方法不能得到有效的分离。

5.正相色谱和反相色谱

正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性。因此，在这种层析过程中非极性分子或者极性小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从色谱柱中流出来。正相色谱用的固定相通常为硅胶以及具有胺基团和氰基团等其他极性官能团的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基或其他极性基团极性较强，因此，分离次序是依据样品中各组分的极性由弱到强被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对固定相低，如正己烷、氯仿、二氯甲烷等。

反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性。在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快，先从色谱柱中流出来。反相色谱用的填料通常是硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱的官能团。反相色谱使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。

一般来说，分离极性大的分子（带电离子等）采用正相色谱，而分离极性小的有机分子（有机酸、醇、酚等）多采用反相色谱。