荧光分析法的定性与定量分析

1.定性分析研究

在食品生物化学实验中应用荧光分析法，能够定性分析蛋白质在提取、加工或变性后，蛋白质疏水性、亲水性的变化；研究有机小分子、离子以及无机化合物与蛋白质的相互作用，获取对蛋白质结构及功能性质变化的信息等。

在蛋白质结构中存在三种芳香族氨基酸，即色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr），它们能发出内源荧光，这些氨基酸的结构不同，荧光强度比为100∶0.5∶9，因此，绝大多数情况下，可以认为蛋白质所显示的荧光主要来自色氨酸残基的贡献，色氨酸荧光光谱主要反映色氨酸微环境极性的变化，是一种较为灵敏、在三级结构水平上反映蛋白质构象变化的技术手段。一般来讲，荧光峰红移表明荧光发射基团暴露于溶剂，蛋白质分子伸展；如果荧光峰位置没有发生偏移，仅有荧光峰信号的减弱或增强，那么不能将其判断为明显的蛋白质构象改变。

在测定蛋白质的性质时，可以对蛋白质对照液进行荧光光谱扫描，以确定样液最合适的发射波长，然后测定处理样品荧光发射光谱，根据发射光谱最大发射波长的位置，判断蛋白质构象的变化。如果最大荧光发射波长红移，表明蛋白质残基所处环境的极性增加，蓝移则说明蛋白质疏水性增加。

荧光分光光度计法还可以用来对蛋白质水解进行研究。例如，在酶对蛋白质的水解作用过程中，随着酶解作用时间的延长，对酶解液进行荧光光谱分析时，其荧光峰会发生红移，说明酶解液中可溶性蛋白质的含量增加。

2.足量测定

荧光分析法的定量分析方法主要可分为直接测定法和间接测定法两类。

（1）直接测定法。

利用荧光分析法对被分析物质进行浓度测定，最简单的方法就是直接测定法。某些物质只要本身能够发出荧光，则只需将含有这类物质的样品做适当的前处理或分离除去干扰物质，便可通过测量它的荧光强度从而测出其浓度。具体有以下两种方法。

①直接比较法。配制标准溶液，使其浓度在标准曲线的线性范围之内，测定其荧光强度Fs，在相同条件下测定样品溶液的荧光强度Fx，已知标准溶液的浓度cs，便可求出样品中待测溶液的含量。

如果空白溶液的荧光强度调不到零，则必须从Fs和Fx值中扣除空白溶液的荧光强度F0，然后进行计算。(www.xing528.com)

Fs-F0=Kcs，Fx-F0=Kcx

②标准曲线法。将已知量的标准品经过与样品相同处理后，配成一系列标准溶液，分别测定其荧光强度，以荧光强度对荧光物质含量绘制标准曲线。再测定样品溶液的荧光强度，根据标准曲线即可求出样品中待测荧光物质的含量。

为使各次所绘制的标准曲线能够重合一致，每次需以同一标准溶液对仪器进行校正。若该溶液在紫外光照射下不稳定，需要改用另外一种稳定且荧光峰相近的标准溶液进行校正。例如，在测定维生素B1时，可用硫酸奎宁作为基准来校正仪器；测定维生素B2时，可用荧光素钠溶液作为基准来校正仪器。

（2）间接测定法。

有许多物质本身不能发荧光，或者荧光量子产率很低，仅能显现非常微弱的荧光，无法直接进行测定，这时可采用间接测定方法。

间接测定法主要有以下三种。

①荧光猝灭法。利用本身不发荧光的被分析物质能使某种荧光化合物的荧光淬灭的性质，通过测量荧光化合物荧光强度的下降，间接地测定该物质的浓度。

②化学转化法。通过化学反应使非荧光物质变为适合于测定的荧光物质，从而间接地测定该物质的浓度。例如，金属离子与螯合剂反应生成具有荧光的螯合物；有机化合物通过光化学反应、降解、氧化还原、酶促反应等，使其转变为荧光物质。

③敏化发光法。对于很低浓度的分析物质，若采用一般的荧光测定方法，由于荧光信号太弱而无法检测，这时便可利用一种物质（敏化剂）以吸收激发光，然后将激发光能传递给发荧光的分析物质，从而提高被分析物质测定的灵敏度。

以上三种方法都只是相对的测定分析方法，在实验时均需采用某种标准进行比较，方能得出结果。