分光光度计法在定量分析和定性检测中的应用

1.定量分析

实际的分析研究中，常用标准曲线定量法（或工作曲线法）和比较定量法。

标准曲线定量法：先配制一系列浓度已知的待测物标准溶液，分别加入显色剂（若物质在紫外区有显示基团，则不必显色，待测定样品也一样），在一定波长条件下测定溶液的吸光值，在坐标纸上或用电脑软件绘制标准溶液的浓度与吸光值的标准工作曲线，计算标准工作曲线的回归方程。然后，用同样的显色方法，在相同操作条件下（相同的试剂和相同的波长）测定样品试液的吸光值，根据标准工作曲线或标准工作曲线的回归方程，进行定量计算（如图3-1所示）。

图3-1　芦丁标准工作曲线

单标准比较定量法：若标准工作曲线通过原点，且呈线性，则可按照的比例关系求cx。式中，As、cs分别为某个标准工作曲线的吸光值和浓度。

另外，因为分光光度计法可以任意选择某种波长的单色光，因此可以利用各种组分吸光度的加和性，在指定条件下进行混合物中各自含量的测定。(www.xing528.com)

2.定性检测

应用紫外可见分光光度计法，依据物质在某特定波长条件下具有对应关系的吸收光谱，与物质的标准谱图对照，可对某些化合物进行定性分析。

（1）紫外可见吸收光谱在蛋白质快速测定中的应用。蛋白质中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，在280 nm处有最大吸收峰，可用紫外可见分光光度计法，对溶液进行吸收光谱扫描，根据吸收光谱图快速鉴别蛋白质的存在与否。

（2）紫外可见吸收光谱在植物天然活性物质（如黄酮类物质等）的分析鉴定中的应用。植物黄酮类化合物的提取及应用研究是食品生物化学研究的热点之一。黄酮类物质由于结构中发色基团的位置不同，各物质在紫外可见光区存在不同的吸收光谱曲线，吸收光谱曲线图可为黄酮类化合物的鉴别及其氧化模式提供重要信息（见表3-1）。

表3-1　黄酮类化合物的紫外可见吸收光谱段范围

（3）天然色素的提取及稳定性研究。果蔬植物中含有丰富的天然色素，经提取制备后可作为食品的天然着色剂。天然色素按化学结构不同可分为吡咯色素、多烯色素、酚类色素、吡啶色素、醌酮色素等，其对光、热、酸、碱等条件的稳定性研究，常用的方法是分光光度计法。检测的方法为：对色素原液进行光谱扫描，确定色素光谱曲线吸收峰的位置，并测定初始色素溶液在最大吸收峰波长下的吸光值；然后定期抽样测定色素在不同处理方法、不同贮存条件下色素溶液的吸光值以及进行吸收光谱曲线扫描。性质稳定的色素溶液，其样液的吸光值大小、扫描吸收光谱最大吸收峰所对应的波长基本保持不变。应根据吸光值大小的变化、吸收光谱曲线最大吸收峰所对应波长位置的变化与否，综合评价天然色素色泽稳定的条件。