分光光度计法实验原理简介

自然界中存在各种不同波长的电磁波，分光光度计法所使用的光谱范围为190～1100 nm，其中190～400nm为紫外光区，400～760 nm为可见光区，760～1100 nm为红外光区。朗伯-比尔定律是分光光度计定量分析的理论依据。

当一束平行单色光（入射光强度为I0）照射到任何均匀、非散射的溶液上时，光的一部分被比色皿的表面反射回来（反射光强度为IT），一部分被溶液吸收（被吸收光强度为Ia），一部分则透过溶液（透光强度为It）。这些数值之间有如下关系：

I0=Ia+It+IT

在分析中采用同种质料的比色皿，其反射光的强度是不变的。由于反射所引起的误差互相抵消，因此上式可简化为

I0=Ia+It(www.xing528.com)

式中，Ia越大说明对光吸收越强，也就是透过光It的强度越小，光减弱得越多。因此，分光光度计分析法实质上是测量透过光强度的变化。不同物质的溶液对光的吸收程度（吸光度A）与溶液的浓度（c）、液层厚度（L）及入射光的波长等因素有关。溶液浓度越大、液层越厚，光被吸收的程度亦增加，透射光的强度则减少。透射光强度与入射光强度的比值，称为透光度，以T表示。当入射光的波长一定时，其定量关系可用朗伯-比尔定律表示，即

式中，a为比例常数，称吸光系数，有两种表示方法：①摩尔吸光系数，是指在一定波长时，溶液浓度为1 mol/L，厚度为1 cm的吸光度，用ε或EM表示；②百分吸光系数或称比吸光系数，是指在一定波长时，溶液质量浓度为1 g/mL，厚度为1cm的吸光度，用表示。

吸光系数两种表示方式之间的关系是

式中，Mt是吸光物质的摩尔质量。吸光系数ε或不能直接测得，需用已知准确浓度的稀溶液测得吸光值换算而得到。例如，氯霉素（Mt=323.15）的水溶液在278 nm处有吸收峰。设用纯品配制100 mL含2 mg氯霉素的溶液，以1.00 cm厚的比色皿在278 nm处测得透光率为24.3%，吸光值为0.614，则