烟草中淀粉的连续流动法分析方法

淀粉是由若干个葡萄糖分子聚合而成的天然高分子化合物。淀粉组成可以分为两类，直链淀粉与支链淀粉。直链淀粉中葡萄糖分子之间以α-1，4-糖苷键相连，而支链淀粉中葡萄糖分子之间除了以α-1，4-糖苷键相连外，还有以α-1，6-糖苷键相连的。结构如图3-8，图3-9所示。

图3-8 直链淀粉的结构（α-1，4-苷键）的一部分

图3-9支链淀粉的结构（α-1，4-苷键和α-1，6-苷键）的一部分

淀粉是烟草中一类重要的碳水化合物，其在烟叶片细胞中的合成、积累、分解、转化状况，决定着烤后叶片内部各种化学成分之间的协调程度，对烟叶色、香、味有不同影响，即影响烟叶的外观和内在品质，一方面淀粉会影响燃烧速度和燃烧的完全性，另一方面淀粉在燃吸时会产生糊焦气味，使烟草的香味变坏。烟叶经调制、发酵后，淀粉大多转化为小分子碳水化合物，这些小分子碳水化合物参与烟气酸碱平衡，对烟气醇和性与芳香性具有重要作用。因此，淀粉是评价烟草品质的重要指标之一，测定调制前后烟叶中的淀粉含量具有重要意义。

一、方法概述

由于烟草化学成分十分复杂，且烟草淀粉的分离比较困难，长期以来淀粉被认为是较难测定的烟草化学成分之一。根据淀粉不同化学特性形成了三种不同的分析方法：碘显色法、酶水解法和酸水解法。碘显色法简便、快速，适合于常规分析。酶水解法和酸水解法均是测定水解产生的葡萄糖，操作步骤多，分析效率低，且酸水解法能将淀粉之外的多糖水解而得到偏高的结果。烟草淀粉的分析方法的特点如表3-15所示。

表3-15 烟草淀粉的分析方法的特点

1. 碘显色法

碘显色法的基本原理就是利用淀粉的化学性质，碘遇淀粉生成蓝色的包合物，而且淀粉跟碘生成的包合物的颜色，跟淀粉的聚合度或相对分子质量有关。直链淀粉遇碘呈蓝色，最大吸收波长为610nm，支链淀粉遇碘呈紫红色，最大吸收为550nm。由不同比例的直链淀粉和支链淀粉配制标准溶液，所得溶液的最大吸收波长不同。

根据萃取淀粉的方法不同，可以分为水萃取淀粉和酸萃取淀粉两种。水萃取淀粉就是用水加热沸腾，将淀粉糊化，从而将淀粉从烟草中分离出来。张峻松等采用沸水萃取烟末5 min，经过洗涤和过滤，然后进行显色和吸光度法测定，建立了一种烟草淀粉测定新方法。该方法回收率在96%～105%之间，相对标准偏差为0.97%。酸萃取淀粉就是通过高氯酸氢键断开剂来选择性溶解淀粉分子，从而在常温下萃取烟草中的淀粉。吴玉萍等用该法达到分离淀粉与非淀粉的目的。烟叶中萃取出来的淀粉与碘酸钾和碘化钾反应生成的碘进行碘显色，即用连续流动法测定烟草中的淀粉含量，建立了简便、快速、准确测定烟草淀粉的方法。该方法回收率为96.71%，相对标准偏差在1.79%～5.58%之间。

由于烟草中存在植物色素和醌类等有颜色的物质，会干扰碘—淀粉的比色测定，烟草中含有糖类化合物，其存在会影响样品溶液的测定，因此在建立方法的过程中要尽量降低植物色素、醌类和糖类化合物对实验结果的影响。

2. 酸水解法

酸水解法就是将淀粉在酸和热的作用下，水解生成葡萄糖，再采用连续流动法对其进行测定，最后折算成淀粉。淀粉水解反应与温度和酸催化剂有关，催化效能较高的为盐酸和硫酸，目前使用最多的水解催化剂为盐酸。

由于淀粉在酸作用下，不但发生水解反应，而且还会发生复合反应和分解反应，但在淀粉水解时一部分半纤维素、果胶之类的物质也会发生水解，产生木糖，阿拉伯糖等干扰淀粉测定，造成淀粉的测量结果偏高。因此实验过程中必须严格控制实验条件，尽可能抑制副反应的发生。

3. 酶水解法

淀粉在一定酸度下，与酶的作用能够水解生成葡萄糖，然后采用连续流动仪实现间接测定烟草淀粉。能够使淀粉水解的淀粉酶主要有：α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、异淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶。酶对淀粉的催化水解具有专一性。不同的淀粉酶催化水解淀粉的糖苷键不同，有的酶能使α-1， 4糖苷键断裂，有的酶能使α-1，6糖苷键断裂，使淀粉水解生成葡萄糖。但烟草中含有大量的糖类化合物，都能够水解生成葡萄糖，从而影响烟草淀粉的间接测定。

瞿先中等先采用耐高温淀粉酶于95℃下处理，再用糖化酶于55℃下处理，然后采用连续流动分析法测定了烟叶样品中的淀粉含量，方法的相对标准偏差为2.0%，回收率在96%～100%之间。刘华等将烟草中淀粉经淀粉酶水解成单糖后，利用DNS（3，5-二硝基水杨酸）比色法测定其还原糖，从而实现间接测定烟草淀粉，回收率为98%～102%。聂聪等利用一种在淀粉中的葡萄糖苷酶（A GS）将烟草中的淀粉水解为葡萄糖，用连续流动仪测定烟草中淀粉含量，其方法回收率为96.6%，变异系数为1.52%～4.08%，并比较了其与酶水解法（ISO方法）、酸水解法和碘显色法测定烟草中淀粉含量的差异。廖堃等先用5%乙酸水溶液除去烟草样品中的可溶性糖后，再经α-淀粉酶、β-淀粉酶酶水解，然后用连续流动法测定样品中的淀粉含量，方法的回收率大于93%，相对标准偏差为4.37%。

本节重点介绍改进雷诺公司方法——连续流动法测定烟草中淀粉。雷诺公司的方法为采用甲醇-氯化钠饱和溶液在72℃水浴20min条件下去除样品色素，然后静置，用高氯酸萃取淀粉。操作中涉及样品转移、高速离心等方法，且需要手工操作，具有步骤多，样品有损失等缺点。改进雷诺公司方法，采用研制的一种G3烧结玻璃砂芯漏斗，使色素及干扰物质的去除和淀粉萃取在同一个装置内完成，避免样品转移造成不必要的损失。采用甲醇-氯化钠饱和溶液超声去色素，超声-高氯酸萃取烟草中的淀粉，连续流动法测定烟草中的淀粉含量，方法样品前处理简单、快速、高效、准确性高。

二、方法原理

采用甲醇-氯化钠饱和溶液超声去除样品中色素及干扰物质，用高氯酸超声萃取烟草中的淀粉，在酸性条件下，样品萃取液中的淀粉与碘发生显色反应，其最大吸收波长为575 nm，用比色计测定其吸收。

三、材料与方法

（一）试剂

采用连续流动法分析烟草中淀粉所需的试剂见表3-16。

表3-16 分析烟草中淀粉所需试剂列表

1. 试剂配制

（1）75%乙醇氯化钠饱和溶液 称取80g氯化钠，溶于250mL水中，加入750mL无水乙醇，搅拌溶解，静置，待溶液澄清后过滤。

（2）碘/碘化钾溶液 称取5.0g碘化钾和0.5g碘于400mL烧杯中，用玻棒研磨粉碎混匀后加入少量水溶解，待完全溶解后，转入250mL容量瓶中，用水定容至刻度。该溶液常温下避光保存，有效期为1个月。

（3）40%高氯酸溶液 移取300mL高氯酸溶液，缓慢溶解于224mL的水中，摇匀即可。

（4） 15%高氯酸溶液 移取112mL高氯酸溶液，缓慢溶解于224mL的水中，摇匀即可。

（5）0.1%十二烷基磺酸钠溶液（活化水）称取0.5 g十二烷基磺酸钠，溶解于500mL水，溶解澄清。

2. 标准溶液配制

（1）淀粉标准储备液 分别称取0.15g直链淀粉和0.60g支链淀粉于烧杯中，精确至0.0001g。直链淀粉中加入1.0g氢氧化钠后用水煮沸溶解，支链淀粉用水煮沸溶解，冷却后分别转入500mL容量瓶中，用水定容至刻度。该溶液0～4℃保存，有效期为1个月。

（2）混合标准储备液 分别移取直链淀粉储备液和支链淀粉储备液各30mL于100mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，得到混合标准储备液。

（3）系列标准工作液 分别移取不同体积的混合标准储备液于50mL容量瓶中，并分别加入2.5mL高氯酸萃取液，用水定容至刻度。制备至少5个标准工作液（其浓度范围应覆盖预计检测到的样品含量），该系列标准工作液应现配现用。

（二）仪器

常用实验仪器如下。

（1）连续流动分析仪，由取样器、比例泵、渗析器、加热槽、混合圈、比色计（配570nm滤光片）和记录仪组成。(www.xing528.com)

（2）紫外-可见分光光度计。

（3）分析天平，感量0.0001 g。

（4）超声波发生器。

（三）实验方法

称取烟草样品0.2g置于50mL G3烧结玻璃漏斗中，加入25mL 75% 甲醇-氯化钠饱和溶液，将漏斗放入盛有适量水的400mL烧杯中，室温下超声去除色素25min。取出漏斗，过滤弃去上层液体；再加入15mL 40% 高氯酸溶液，超声10min萃取烟草淀粉，然后加入15mL水，过滤收集萃取液于250mL容量瓶中，定容后摇匀。此淀粉萃取液可以采用分光光度法和连续流动法进行测定。连续流动法测定淀粉的流程图如图3-10所示。

图3-10 淀粉的自动分析仪流程图

上机运行工作标准液和样品液。如果样品液浓度超出工作标准液的浓度范围，则应稀释。

四、结果的计算与表述

1. 淀粉含量的计算

a表示以干基试样计的淀粉的含量，数值以%表示，由式（3-6）计算：

式中 c——样品溶液中淀粉的仪器观测值，mg/mL；

v——萃取液的体积，mL；

m——试样的质量，mg；

w——试样水分的质量分数，%。

2. 结果的表述

以两次平行测定结果的平均值作为测定结果，结果精确至0.01%。两次平行测定结果的相对平均偏差不应大于10%。

五、影响烟草中淀粉测定的因素

1. 直链淀粉和支链淀粉

烟草中的淀粉由直链淀粉和支链淀粉构成，一般认为二者的比例为2∶8，不同的烟草类型和品种、部位等均会影响二者的比例。直链淀粉遇碘呈蓝色，最大吸收波长为610nm，支链淀粉遇碘呈紫红色，最大吸收为550nm。由不同比例的直链淀粉和支链淀粉配制标准溶液，所得溶液的最大吸收波长、标准曲线的斜率均不相同。因此，我们需选择与烟草直链/支链淀粉链长比较接近的标准品，配制适合烟草中淀粉测定的直链淀粉和支链淀粉比例的标准溶液。

以往研究表明，其他植物中的淀粉虽然都有直链淀粉和支链淀粉，但构成比例、长度均有一定差异，吸光度也有一定差异，只有土豆淀粉和烟草淀粉链长类似，因此适宜选择土豆直链淀粉和支链淀粉，配制标准溶液中直链淀粉与支链淀粉的比例为1∶4。

2. 干扰物质去除方式

由于烟草中有植物色素和醌类等有颜色的干扰物质，因此必须把它们除去或绝大部分除去，从而降低干扰物对淀粉比色测定的影响。

按方法分别选择超声和水浴两种方式进行去色素实验20min，以蒸馏水为空白参比，用分光光度计测定淀粉萃取液的背景吸收，结果见表3-17。结果表明：超声和水浴都可以去除色素干扰，超声效果更好。

表3-17 去干扰方式

3. 超声去色素时间

超声作用去色素：称取6份实验样品，依次超声5min、10min、20min、30min、40min、50min去色素，按实验方法进行分光光度法测定，结果见表3-18。结果表明：超声20min后，样品溶液的背景吸收基本保持不变（样品的背景干扰不能够完全去除），测定样品溶液的淀粉含量保持不变，即选择超声去色素时间为30min。

表3-18 超声去色素时间的选择

4. 淀粉萃取方式

淀粉萃取方式对样品淀粉测定结果有较大影响（图3-11所示），动态萃取效果要有优于静态萃取效果，超声高氯酸萃取烟草中的淀粉效果优于振荡和静置法。

图3-11 淀粉萃取方式对测定结果的影响

5. 超声对淀粉-碘显色特性的影响

取某一浓度的淀粉工作标准液6份，20mL/份，分别超声5min、10min、20min、30min、50min、60min，按实验方法进行分光光度法测定，测得各自溶液的吸光度之间RSD为0.26%，从而表明超声作用对淀粉的碘显色特性的几乎没有影响。

6. 不同方法比较

考察了雷诺公司方法、分光光度法和连续流动法3种分析方法检测结果，如表3-19所示。雷诺方法实验结果偏低，而分光光度法和连续流动法结果高，这是由于雷诺方法采用高氯酸静置萃取淀粉效果差造成的。而分光光度法比连续流动法试验结果略高，这是由于连续流动法无法扣除样品的背景造成的。

表3-19 三种方法比较

注：雷诺方法采用水浴法去除干扰物质，静置状态下高氯酸提取烟草中的淀粉，其他同实验方法。