生物碱是一类存在于生物体（主要为植物）中的一类含氮的碱性有机化合物，有似碱的性质，也称为植物碱。烟草中含有多种生物碱，按其分子结构分为两类，一类是吡啶与氢化吡咯环相结合的化合物，如烟碱（尼古丁）、去甲基烟碱（降烟碱）、去氢去甲基烟碱（麦斯明）、二烯烟碱（尼古替啉）等；另一类是吡啶环与吡啶或氢化吡咯环相结合的化合物，如新烟碱（阿那培新）、甲基新烟碱、去氢新烟碱（阿那他明）、N-甲基去氢新烟碱、2， 3-二吡啶等。烟草总植物碱是指烟草中所有的生物碱。烟草生物碱以烟碱最重要，它占烟草生物碱总量的95%以上，其次是去甲基烟碱（降烟碱）、新烟碱等，故在测定烟草总植物碱的含量时，常以烟碱计。研究表明，烟碱含量和烟叶品质密切相关。通过检测烟碱含量与烟叶厚度、种植密度的关系，可以在生产中降低烟叶烟碱含量，提高烟叶的可用性。烟碱含量在医学上也是重要指标，可缓解和治疗多种疾病，如帕金森病、阿尔茨海默病、神经衰弱、记忆衰退等。
一、方法概述
自1960年连续流动分析法首次应用于烟草总植物碱，至20世纪80年代初分析方法已基本成熟。
总植物碱的连续流动分析采用戊烯二醛反应。所谓戊烯二醛反应，就是用溴化氰（CNBr）将吡啶类化合物的吡啶环断开，然后与芳香胺反应生成桔黄色的化合物。该化合物稳定性较差。1942年，Werle和Becker研究了烟碱与α-萘胺、β-萘胺、联苯胺和苯胺的Konig反应，研究发现：（1）在水溶液中反应时，α-萘胺、β-萘胺和联苯胺均产生浑浊，无法用于比色分析，苯胺不产生浑浊，可用于比色分析。（2）试剂的加入次序、溶液pH、反应时间、试剂浓度均对反应产物的吸光度产生影响。（3）反应最佳pH为6.1，苯胺浓度为0.01mol/L时吸光度达到最大。（4）其他条件不变时，吸光度随溴化氰浓度的增加而增加，先向烟碱溶液中加入苯胺，或与溴化氰同时加入，达到最大吸光度的反应时间为4～5min，最大吸收波长为480nm。若将溴化氰先于苯胺加入溶液，则溴化氰与植物碱反应的中间产物会继续发生反应，生成其他化合物，不能形成测定需要的化合物。
1960年，Sadler首次将Konig反应用于总植物碱的连续流动分析，用于流动分析的为烟末的碱性水蒸气蒸馏馏出液。Sadler研究发现，随着pH的降低，吸光度增加，pH=5.4时达到最大，此时最大吸收波长为460nm。Sadler还发现，较低的pH有利于比色池冲洗干净，能有效避免样品之间的拖带污染。另外，加入20%甲醇降低溶液的表面张力也有利于将比色池冲洗干净。与硅钨酸重量法相比，Sadler方法的准确度达到±0.01% （绝对值）。
Sadler实现了总植物碱的连续流动分析，而且有很高的准确度，但缺点是必须使用烟末的碱性水蒸气蒸馏馏出液，而水蒸气蒸馏操作比较繁琐费时，影响了连续流动分析方法快速高效优点的发挥，制约了分析效率，因此有必要对样品的前处理方法进行简化。1967年，Harvey对此进行了研究，并于1969年做了改进。Harvey采用5%醋酸-20%甲醇水溶液作为萃取剂，同时加入活性炭，样品浸泡过夜后经滤纸过滤，滤液直接用于连续流动分析。活性炭的作用是除去色素等干扰物质，它与样品的比例以1.5∶1较为合适。1969年，Collins采用了另外一种去除干扰物质的方法，即利用渗透膜的选择性渗透作用使烟碱透过而大分子的干扰物质不透过或少透过。他的萃取方法是用萃取剂浸泡样品过夜，经滤纸过滤后滤液直接进样。他还研究了多种萃取剂的萃取效率，有硫酸溶液（0.05mol/L，0.5mol/L，1.7mol/L）、氢氧化钠溶液（0.1mol/L，1mol/L、3mol/L）、0.4%硼酸溶液、0.2mol/L盐酸-20%甲醇水溶液、水等。在这些萃取剂中，只有0.2mol/L盐酸-20%甲醇水溶液对各种类型烟草的萃取效率在95%以上。据报道，Harvey和Collins方法的准确度基本与分光光度法相同。Harvey和Collins的方法均大大简化了样品的前处理操作，提高了工作效率。两种方法相比，Harvey的方法需要加入萃取剂和活性炭悬浮液两步移液，Collins的方法只需一步移液操作，因此Collins的方法更为简便，试剂也更为节省。Charles曾成功地用Collins的方法测定了总粒相物中的总植物碱（萃取剂为异丙醇）。
1976年，Davis在进行同一萃取液同时分析还原糖和总植物碱两种成分的研究时，将样品的前处理方法改进为用5%醋酸水溶液萃取振荡10min，可有效萃取还原糖和总植物碱，避免了强酸对低聚糖的水解。同时，改用在水中溶解性能较好的对氨基苯磺酸代替苯胺。研究表明反应最佳pH为7.0，最大吸收波长为460nm。
溴化氰具有剧毒、易挥发、易爆炸、易分解的性质，日常的使用和储存非常不便。1981年，Harvey在Davis方法的基础上，借鉴氰离子与氯胺T反应生成氯化氰的原理，在自动分析仪上在线反应产生氯化氰，代替溴化氰，克服了溴化氰的缺点，取得了良好的效果。Harvey发现，氯胺T与氰化钾应尽可能同时导入流路，且氰化钾先导入，如果氯胺T先导入则会先与对氨基苯磺酸反应，干扰测定，最好是氰化钾和氯胺T先在线混合后导入分析流路。
国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）于1994年发布了No.35推荐方法，它与Harvey改进的Davis方法基本相同，采用水为萃取剂振荡萃取30min。如果同一萃取液同时测定总植物碱和还原糖，则以5%醋酸水溶液为萃取剂。2002年烟草行业标准方法YC/T 160—2002《烟草及烟草制品 总植物碱的测定 连续流动法》等效采用CORESTA第35号推荐方法。这两种方法均采用剧毒品的氰化钾作为反应试剂，给日常分析、管理带来诸多不便。2011年，CORESTA化学常规分学组研究了用硫氰酸钾和次氯酸钠（或二氯异氰尿酸钠）在线反应生成氯化氰代替氰化钾和氯胺T反应的研究。因为硫氰酸钾、次氯酸钠、二氯异氰尿酸钠都是无毒的，该方法的安全性提高了一大步。但相比氰化钾和氯胺T的反应，其灵敏度≤50%。
2013年张威等对CORESTA方法进行改进，采用硫氰酸钾和二氯异氰尿酸钠反应原理，研究制定烟草行业标准方法YC/T 468—2013 《烟草及烟草制品总植物碱的测定 连续流动硫氰酸钾法》。该方法从实验操作和测试稳定性考虑，采用稳定性好的二氯异氰尿酸钠固体粉末，水解后有效氯能达到60%～63%，用前不需要滴定，克服了采用不稳定的液体次氯酸钠，用前要滴定确定有效氯浓度的问题。2017年，CORESTA组织根据此标准形成CORESTA推荐方法No.85 《烟草中总植物碱的测定KSCN/DCIC连续流动法》。
本节重点介绍采用硫氰酸钾和二氯异氰尿酸钠反应原理测定烟草中总植物碱含量的实验内容。
二、方法原理
利用硫氰酸钾和二氯异氰尿酸钠在线反应生成氯化氰，在pH=7.0条件下，样品萃取液中的总植物碱（以烟碱计）与对氨基苯磺酸和氯化氰反应，反应物用比色计在460nm测定。
氯化氰的生成是方法实现的关键步骤。反应原理：
三、材料与方法
（一）试剂
除非特殊说明，所有试剂应为分析纯或同等纯度。水应为蒸馏水或同等纯度的水。分析烟草中总植物碱所需试剂见表3-2。
表3-2 分析烟草中总植物碱所需试剂列表
续表
1. 试剂配制
（1）Brij-35溶液（聚乙氧月桂醚）将250g Brij-35加入到1 L水中，加热搅拌直至溶解。
（2）缓冲溶液A称取65.5g磷酸氢二钠、10.4g柠檬酸至烧杯中，加入700mL水搅拌溶解，然后转入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，加入1mL Brij-35溶液，混匀。使用前用定性滤纸过滤。
（3）缓冲溶液B称取222g磷酸氢二钠、8.4g柠檬酸、7g对氨基苯磺酸至烧杯中，加入800mL水搅拌溶解，然后转入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，加入1mL Brij-35溶液，混匀。使用前用定性滤纸过滤。
（4）硫氰酸钾溶液 称取2.88g硫氰酸钾至烧杯中，加入100mL水搅拌溶解，然后转入250mL容量瓶中，用水定容至刻度。
（5）二氯异氰尿酸钠溶液 称取2.20 g二氯异氰尿酸钠至烧杯中，加入100mL水搅拌溶解，然后转入250mL容量瓶中，用水定容至刻度。该溶液应现配现用。
（6）解毒溶液A称取1g柠檬酸、10g硫酸亚铁至烧杯中，加入500mL水搅拌溶解，然后转入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度。
（7）解毒溶液B称取10g碳酸钠至烧杯中，加入500mL水搅拌溶解，然后转入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度。
2. 标准溶液
（1）标准储备液 称取适量烟碱于250mL容量瓶中，精确至0.0001g，用水溶解，定容至刻度。此溶液烟碱含量应在1.6 mg/mL左右。标准储备液应储存于0～4℃冰箱中。有效期为一个月。
（2）系列标准工作溶液 由标准储备液制备至少5个系列标准工作溶液，其浓度范围应覆盖预计检测到的样品含量。该工作溶液在0～4℃冰箱中保存，有效期为2周。
（二）仪器
常用实验仪器如下。
（1）连续流动分析仪，由取样器、比例泵、渗析器、加热槽、混合圈、比色计（配460nm滤光片）和记录仪组成。
（2）分析天平，感量0.0001 g。
（3）振荡器。
（三）实验方法
准确称取0.25g （精确至0.0001g）样品至50mL具塞三角烧瓶中，加入25mL 5% 醋酸或去离子水，盖上塞子。室温下振荡30min后过滤，弃去前几毫升滤液，使用连续流动分析仪测定，测定管路见图3-2。上机运行系列标准工作溶液和样品溶液，如果样品溶液浓度超过标准工作溶液的浓度范围，则应稀释后再测定。
图3-2 测定烟草中的总植物碱管路图
四、结果的计算与表述
1. 总植物碱（以烟碱计）含量的计算
a表示以干基试样计的总植物碱（以烟碱计）的含量，数值以%表示，由式（3-2）计算：
式中 c——萃取液总植物碱的仪器观测值，mg/mL；
v——萃取液的体积，mL；(www.xing528.com)
m——试样的质量，mg；
w——试样水分的质量分数，%。
2. 结果的表述
以两次平行测定结果的平均值作为测定结果，结果精确至0.01%。两次平行测定结果绝对值之差不应大于0.05%。
五、影响烟草中总植物碱测定的因素
1. 反应最佳吸收波长
不同浓度标准溶液和待测样品溶液吸收曲线（图3-3所示），反应最佳吸收波长为463nm，由于仪器配套滤光片的波长基本都是10的倍数，连续流动法检测采用460nm滤光片。
图3-3 不同浓度标准样品和测试样品的紫外可见吸收光谱曲线
2. 最佳反应条件的实现
（1）最佳检测pH的实现
根据Sadeler和Harvey等研究表明，萃取液中的总植物碱（以烟碱计）与对氨基苯磺酸和氯化氰反应，最佳反应pH为7.0，反应物用比色剂在460nm测定。氰化钾法所使用的试剂pH如表3-3所示。
表3-3 氰化钾法所使用的试剂pH
由于采用硫氰酸钾和二氯异氰尿酸钠在线反应生成氯化氰，硫氰酸钾的pH为4.97，二氯异氰尿酸钠的pH为5.27，这两种溶液混合后会影响整个反应的酸碱环境。经过实际测定，洗针液为5%醋酸时，进入检测器溶液的pH为5.20；洗针液为水时，进入检测器溶液的pH为6.22，均不在最佳反应pH，因此需要对缓冲溶液B进行调整。由于缓冲溶液B配置使用了磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O），通过调整该物质的质量可以调整缓冲溶液B的pH，调整情况如表3-4所示。
表3-4 缓冲溶液B调整实验
由表3-4可知当缓冲溶液B中Na2HPO4·12H2O质量为262g/L时，进入检测器溶液pH约为7.00，满足最佳反应pH要求。
缓冲溶液B配置为：称取262g Na2HPO4·12H2O，10.4gC6H8O7·H2O和7.0g对氨基苯磺酸，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，加入1mL Brij-35，用蒸馏水稀释至1L。使用前用定性快速滤纸过滤。
（2）KSCN和二氯异氰尿酸钠的最佳浓度条件
硫氰酸钾和二氯异氰尿酸钠实验浓度见表3-5。
表3-5 二氯异氰尿酸钠浓度
表3-6 硫氰酸钾浓度
注：以上溶液配制都定容100mL容量瓶。
采用对烤烟、白肋烟、香料烟、烤烟型卷烟和混合型卷烟进行正交实验测定，结果表明A2-B1和A3-B2条件最佳，这一结果与A. P. Brady和Michael L. Pinsky等人的研究结果相一致，即SCN-∶DCIC≈3∶1为最佳配比。考虑到方法生成的氯化氰必须过量，选择SCN-∶DCIC=2.88g∶2.20g=0.12mol/L∶0.04mol/L是适宜的。
3. 方法检出限比较
连续流动分析方法的检出限是根据美国国家环境保护局（EPA）方法第136部分 附录B来确定的。EPA方法用一连串的最高浓度标准工作溶液的2%浓度溶液进行10个重复测量3次，得到标准偏差再乘以相应t值，即MDL（method detection limit）=（s）*（t-value）=（s）*
。标准品10个，自由度为9，
，即MDL=2.821 *（s），得到的结果值表示方法检出限具有99%可信度。定量限的计算是LOQ（Limit of Quantitation）=10*（s）。
按氰化钾法和硫氰酸钾法，配置最高浓度标准工作溶液的2%浓度溶液10份，每份重复测量3次，按EPA方法计算得到方法的检出限和定量限，结果见表3-7、表3-8。
表3-7 氰化钾法的检出限和定量限
标准偏差S——0.022
检出限/%——MDL=0.022*2.821=0.063
定量限/%——LOQ=10*0.022=0.220
表3-8 硫氰酸钾法的检出限和定量限
标准偏差S——0.016
检出限/%——MDL=0.016*2.821=0.045
定量限/%——LOQ=10*0.016=0.160
氰化钾法的检出限和定量限分别为0.063%和0.220%，硫氰酸钾法的检出限和定量限分别为0.045%和0.160%，两方法均达到检测要求。
4. 方法比对
将烤烟、白肋烟、香料烟、烤烟型卷烟和混合型卷烟五个样品，分别采用氰化钾方法和硫氰酸钾的测定结果进行比较，结果见表3-9，同一样品采用硫氰酸钾测定结果相对于氰化钾法的相对误差均小于5%。对同一样品分别采用硫氰酸钾或氰化钾方法的两组测定结果进行配对t检验，结果为t=1.39，t0.05=2.78，t＜t0.05，说明两种分析方法没有显著性差异，表明硫氰酸钾法与氰化钾方法结果一致。
表3-9 硫氰酸钾法与氰化钾法测定总植物碱结果对比
5. 注意事项
（1）配置缓冲溶液B时，应核查Na2HPO4·12H2O和C6H8O7·H2O试剂所带结晶水数量，出现白色沉淀往往与此有关。
（2）每次配置试剂后，样品检测前应用精密pH试纸检测从检测器流出反应液的pH是否为7.0。
（3）样品测定要做最少两次平行测定，以其平均值作为检测结果，精确至0.01%，且两次测定结果的绝对值之差不应大于0.05%。
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