烟草中水溶性总糖和还原糖的测定方法

糖类物质是自然界中分布最为广泛的一类化合物，在烟草植物体中的含量可达干重的25%～50%，是影响烟草品质的重要因素之一。测定烟草中的糖类，对烟草的生产、吸烟与健康等方面的研究具有实际意义。从结构上看，糖类是一大类多羟基醛或多羟基酮以及水解后能够产生多羟基醛或多羟基酮的化合物。根据分子中单糖数目把糖类物质分为三类：单糖如葡萄糖和果糖；低聚糖如二糖、三糖；多聚糖如糊精、淀粉、纤维素、果胶、半纤维素等。

一、概述

烟草中糖的连续流动分析，最初是利用单糖的还原性质，在碱性介质中把黄色的铁氰化钾还原为无色的亚铁氰化钾，通过测定吸光度的降低得出糖的含量。样品前处理一般采用萃取法，干扰物质则通过采用萃取时加入活性炭或在流路中采用渗析膜除去。铁氰化钾测糖最为代表性的方法，是1969年报道的Harvey采用5%醋酸-20%甲醇水溶液为萃取剂，以活性炭去除干扰物质，通过一种连续流动装置实现了还原糖和总植物碱的同时自动分析。在样品溶液与铁氰化钾反应之前加入盐酸溶液将双糖水解，则可测定烟草中的水溶性总糖。但随着研究的深入，发现这个方法存在着两个方面的严重缺点：（1）灵敏度低。由于铁氰化钾法是利用铁氰化钾黄色的减褪来进行测定，因此颜色必须减褪到一定程度光度计才能检测出来，一般来说萃取液糖的浓度至少应达到0.125 mg/mL才可检测出来，这就限制了方法的灵敏度。（2）反应的专一性差。Davis发现果糖和葡萄糖仅占铁氰化钾法测出的总还原糖的71%，而据Koiwai的报道，除果糖和葡萄糖之外，烟草中的其他糖类只占2%。这就说明铁氰化钾法测出的所谓糖其实有相当一部分不是糖，而是将一些能够还原铁氰化钾的非糖还原性物质也当做了糖。但由于铁氰化钾法具有简单方便、试剂便宜的优点，目前仍有比较多的应用，如CORESTA的No.37推荐方法《烟草中还原性物质的连续流动分析》即采用的该原理。

1972年，M. Lever在研究抗代谢物质异烟酸酰肼的测定方法时，发现芳香酸酰肼与β-二酮的稀溶液在碱性介质中反应产生黄色的阴离子，将溶液中和为中性时黄色消失。由这个反应他联想到也许可以采用芳香酸酰肼测定人体中的葡萄糖，经过研究，发现：（1）许多酸的酰肼均可与葡萄糖反应，其中以对羟基苯甲酸酰肼（PAHBAH）吸光度最大，且空白溶液吸光值小，反应产物的最大吸收波长为395nm。（2）糖与PAHBAH在碱性溶液中100℃加热5 min吸光度达到最大，并至少稳定5 min，若加热时间过长吸光度有所下降。（3） PAHBAH的最大浓度不宜超过1%，否则空白溶液吸光度增大。（4）试剂的微小变化也会对测定造成较大的干扰。（5）这个反应较为专一，灵敏度高，可检测到1μg的葡萄糖。（6）若存在非常高的蛋白质时干扰测定。（7）钙离子即使很小量也会造成吸光度增加。M. Lever在随后的研究中发现，钙离子（及其他二价阳离子）不但引起反应产物的吸光度增加，而且使最大吸收波长从385～390nm红移至413～415nm。他进一步提出采用络合剂（ED-TA或柠檬酸）络合这些阳离子以去除干扰。1976年，R. E. Davis采用连续流动法证实了M. Lever的结果。他发现，钙离子的存在使最大吸收波长红移，最大至410nm，同时使吸光度增加，波长的红移和吸光度的增加均取决于钙离子的浓度，但当钙离子的浓度过高时（实际反应浓度为0.001mol/L），吸光度会下降。在反应介质中引入柠檬酸后，对最大吸收波长的移动和吸光度影响不大，但吸光度出现了一个平台，这种 “缓冲”现象可使钙离子的浓度即使增加一倍也不会发生吸光度的改变。

R. E. Davis最初是采用萃取液直接进样的。他发现，在分析白肋烟及重组烟草（烟草薄片）时管路中会出现沉淀，使吸光度无法测定。这是由于反应介质的碱性太强造成的。为解决这个问题，他引入了渗析膜除去干扰物质。在分析时，由于该方法灵敏度很高，因此萃取液要稀释进样。采用碱性溶液或水为稀释剂时，分析白肋烟时渗析膜上会逐渐附着一层沉淀，降低检测的灵敏度，若采用醋酸溶液，则不会或很少附着沉淀。Davis研究结果表明吸光度超过0.6时标准曲线会发生弯曲，误差显著增加，因此实际测定时应控制吸光度小于0.6。研究中还发现，虽然葡萄糖和果糖的反应产物的吸光系数完全相同，但采用渗析膜之后，果糖的响应值却比葡萄糖高5%，这反映出果糖的渗析效率高于葡萄糖。

国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）第38号推荐方法《烟草中还原糖的连续流动分析》（详见附录1）规定了烟草和烟草制品中还原糖的连续流动测定方法，采用5%的醋酸萃取样品，萃取液与对羟基苯甲酰肼在85℃的碱性介质中产生黄色偶氮化合物，其最大吸收波长为410nm。

我国依据CORETSA推荐方法No.37和No.38，制定了用于烟草中水溶性总糖和还原糖连续流动法测定的行业标准，YC/T 159—2002 《烟草及烟草制品 水溶性糖的测定 连续流动法》。与CORESTA No.38方法相比，增加了水溶性总糖的测定。

本节重点介绍采用5%乙酸水溶液振荡萃取烟草样品，连续流动法测定其水溶性还原糖和总糖含量的实验研究内容。

二、方法原理

用5%乙酸水溶液振荡萃取烟草样品，萃取液中的糖（水溶性总糖测定时应在90℃下水解）与对羟基苯甲酸酰肼反应，在85℃的碱性介质中生成黄色偶氮化合物，其最大吸收波长为410nm，用比色计测定其吸光度。

三、材料与方法

（一）试剂

除非特殊说明，所有试剂应为分析纯或同等纯度。水应为蒸馏水或同等纯度的水。为得到最佳结果，试剂在使用前应过滤除气；建议使用玻璃纤维滤纸。测定烟草中水溶性总糖和还原糖所需试剂见表3-1。

表3-1 测定烟草中水溶性总糖和还原糖所需试剂列表

1. 试剂配制

（1）Brij-35溶液（聚乙氧月桂醚）将250g Brij-35加入到1 L水中，加热搅拌直至溶解。

（2）活化水1L水中加入0.5mL Brij-35。

（3）0.5mol/L氢氧化钠溶液 将20g氢氧化钠加入到约700mL水中，搅拌溶解，放置冷却后转移至1000mL容量瓶中用蒸馏水定容。加入0.5mL Brij-35，混合均匀。溶液保持清澈透明即可使用。

（4） 1.0mol/L氢氧化钠溶液 将40g氢氧化钠加入到约800mL水中，搅拌溶解，放置冷却后转移至1000mL容量瓶中蒸馏水定容。

（5）0.008mol/L氯化钙溶液 将1.75g氯化钙溶于水中，转移至1000mL容量瓶中用蒸馏水定容。加入0.5mL Brij-35，混合均匀。若氯化钙在溶解过程中产生沉淀，应使用定性滤纸过滤。溶液保持清澈透明即可使用。

（6）5% （体积比）醋酸溶液 将50mL冰醋酸溶于约500mL蒸馏水中，转移至1000mL容量瓶中用蒸馏水定容。混合均匀。此溶液用于制备标准溶液、样品的萃取溶液及连续流动系统清洗液。

（7）活化5%醋酸溶液1 L 5%醋酸溶液，加入0.5mL Brij-35，用于连续流动系统清洗液。

（8）0.5mol/L HCl溶液（水解试剂）在通风橱中，将42mL盐酸（37%）缓慢加入到约500mL蒸馏水中，转移至1000mL容量瓶中用蒸馏水定容。再加入0.5mL 30% Brij-35溶液。混合均匀。溶液保持清澈透明即可使用。

（9）1.0mol/L HCl溶液 在通风橱中，将84mL发烟HCl （37%）缓慢加入到约500mL蒸馏水中，转移至1000mL容量瓶中用蒸馏水定容。混合均匀。溶液保持清澈透明即可使用。

（10）5%对羟基苯甲酸酰肼溶液（PAHBAH）将25g对羟基苯甲酸酰肼溶于约400mL盐酸溶液（0.5mol/L），加入10.5g柠檬酸。用盐酸溶液（0.5mol/L）定容至500mL。置于冰箱中冷藏保存，使用时仅取日需量。注：对羟基苯甲酸酰肼（质量分数大于97%）的纯度非常重要。如果有杂质，将会在管路中形成沉淀。可以用水重结晶进行纯化。如有下列情形则表明对羟基苯甲酸酰肼不纯：

①白色的对羟基苯甲酸酰肼结晶中有黑色颗粒。

②5%对羟基苯甲酸酰肼溶液呈黄色。

③对羟基苯甲酸酰肼在0.5mol/L氢氧化钠溶液中溶解困难。

④溶液中有悬浮颗粒。

⑤基线呈波浪形。

5%对羟基苯甲酸酰肼溶液也可如下制备：向烧杯中加入250mL 0.5mol/L盐酸溶液，加热至45℃，持续搅拌下加入对羟基苯甲酸酰肼和柠檬酸，冷却后转入容量瓶中，用0.5mol/L盐酸溶液稀释至刻度。这种方法的制备对羟基苯甲酸酰肼溶液可避免在管路中形成沉淀。

2. 标准溶液配制

（1）储备液 称取10.0g （精确至0.0001g）D-葡萄糖于烧杯中，用约1000mL蒸馏水溶解并转移至1 L容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。储存于冰箱中。此溶液应每月制备一次。

（2）工作标准液 由储备液用5%醋酸溶液制备至少5个工作标准液，其浓度范围应覆盖预计检测到的样品含量。工作标准液应储存于冰箱中。每两周配制一次。(www.xing528.com)

（二）仪器

常用实验仪器如下。

（1）连续流动分析仪，由取样器、比例泵、渗析器、加热槽、混合圈、比色计（配420 nm滤光片）和记录仪组成。

（2）分析天平，感量0.0001 g。

（3）振荡器。

（三）实验方法

准确称取0.25g （精确至0.0001g）试料于50mL磨口三角瓶中，加入25mL 5%醋酸溶液或去离子水，盖上塞子。室温下在振荡器上振荡萃取30min。用定性滤纸过滤，弃去前几毫升滤液，收集后续滤液作分析用。

上机运行工作标准液和样品液（管路图见图3-1）。如果样品液浓度超出工作标准液的浓度范围，则应稀释。

四、结果的计算与表述

1. 水溶性总糖/还原糖的计算

以干基计的水溶性总糖/还原的含量，以葡萄糖计，由式（3-1）得出：

式中 c——样品液总（还原）糖的仪器观测值，mg/mL；

v——萃取液的体积，mL；

m——试料的重量，mg；

w——试样水分的质量分数，%。

2. 结果的表述

以两次测定的平均值作为测定结果。

若测得的水溶性糖/还原糖含量大于或等于10.0%，结果精确至0.1%；若小于10.0%，结果精确至0.01%。

图3-1 水溶性糖测定管路图

注：测定水溶性总糖时95℃加热槽打开，红/红¹管为1.0mol/L HCl，红/红²管为1.0mol/L NaOH；测定还原糖时95℃加热槽关闭，红/红¹管为活化水，红/红²管为水。

3. 精密度

两次平行测定结果绝对值之差不应大于0.50%。

五、影响烟草中糖测定的因素

影响烟草中糖测定的主要因素有：标准物质选择、葡萄糖标样纯度、反应条件、样品放置时间等，其中葡萄糖标样纯度和反应条件影响较为显著。

1. 葡萄糖标样纯度及标准溶液

葡萄糖（Glucose）是自然界分布最广且最为重要的一种单糖，为无色结晶或白色结晶性或颗粒性粉末；无臭，味甜，有吸湿性，易溶于水。其含五个羟基和一个醛基，具有多元醇和醛的性质；α-D-葡萄糖具有旋光性，比甜度为0.7。通常情况下，葡萄糖含有一个结晶水，作为标准物质使用前应在105℃下烘干4h，使其充分失去结晶水。当检测结果偏高时10%左右时，应考虑葡萄糖标准样未经烘干处理。

标准溶液是否准确直接决定分析结果的准确度，若标准溶液偏高或偏低，则检测结果也偏高或偏低，所以标准溶液的配制要严格。

2. 反应条件

测定烟草及烟草制品的总糖时，水解反应原理要求在95℃和强酸作用下将样品中的多糖水解为葡萄糖，水解完全与否直接影响测定结果。因此连续流动仪管路设计应提供足够的反应时间，酸的强度应满足要求。若管路时间短导致反应时间不够及酸的强度不足，多糖水解反应不完全，会造成检测结果偏低。

不论是测定烟草及烟草制品中的总糖还是还原糖，其显色反应要求在强碱条件和85℃下进行，强碱条件是反应完全的关键。因此要保证进入加热槽时液体的碱度满足要求。反应原理要求显色反应时间为5 min，是为了使待测液体进入连续流动分析仪检测器前温度降低。因此通常设置50匝的反应混合圈，避免待测溶液温度过高，降低溶液的吸光度，使检测结果偏低。

3. 样品放置时间

样品放置时间长短对烟草样品中还原糖测定结果的影响是比较明显的。当样品放置时间过长时，烟草样品中的水溶性淀粉发生水解转化成水溶性糖，使得所测定还原糖的结果明显偏高。因此，要求在实际样品测定过程中，尽快完成样品的检测，才能保证检测数据的准确性。