基本原理：分光光度法测量浓度的方法与原理

一、分光光度法原理

1. 分光光度法

分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。与化学分析法相比，方法灵敏度高，测定下限可达10^-5%～10^-4%，可直接用于微量组分的测定；方法的准确度能满足微量组分测定的要求，测定的相对误差为2%～5%，使用精密度高的仪器，误差可达1%～2%。

在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与不同波长相对应的吸收强度。如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。它们与比色法一样，都以朗伯（Lambert）-比尔（Beer）定律为基础。上述的紫外光区与可见光区是常用的。但分光光度法的应用光区包括紫外光区、可见光区和红外光区。波长范围如下所示。

（1）200～400nm的紫外光区；

（2）400～760nm的可见光区；

（3）2.5～25μm （按波数计为4000cm^-1～400cm^-1）的红外光区。

依据光谱区，分光光度计可分为：紫外分光光度计，可见分光光度计（或比色计）、红外分光光度计。如果吸光质点是原子，其仪器称为原子吸收分光光度计。

2. 基本原理

当一束强度为I₀的单色光垂直照射某物质的溶液后，由于一部分光被体系吸收，因此透射光的强度降至I，则溶液的透光率T为：T=（I₀-I）/I₀

根据Lambert-Beer定律：

A=a·b·c

式中 A——吸光度；

b——溶液层厚度，cm；

c——溶液的浓度，g/dm³；

a——吸光系数。

其中吸光系数与溶液的性质、温度以及波长等因素有关。溶液中其他组分（如溶剂等）对光的吸收可用空白液扣除。

由上式可知，当溶液层厚度b和吸光系数a固定时，吸光度A与溶液的浓度成线性关系。在定量分析时，首先需要测定溶液对不同波长光的吸收情况（吸收光谱），从中确定最大吸收波长，然后以此波长的光为光源，测定一系列已知浓度c溶液的吸光度A，作出A～c工作曲线。在分析未知溶液时，根据测量的吸光度A，查工作曲线即可确定出相应的浓度。这便是分光光度法测量浓度的基本原理。

二、连续流动分析技术原理

连续流动分析（Continous Flow Analysis，CFA）是一种基于分光光度法原理的连续流动分析的自动化分析技术。(www.xing528.com)

CFA的基本工作原理：把生成有色化合物过程中人工需要完成的各种化学反应，通过设计成相互串联的化学反应器，使样品及反应试剂依次进入反应管路中可自动按顺序完成反应（如混合圈代替混合搅拌，透析膜代替过滤，在线加热装置代替手工加热等），最终形成的有色化合物进入分光光度计进行检测，通过电脑软件自动计算出来。系统引入气泡，可将每个样品分成不同的段，在段与段之间充当屏障以防止交叉污染，因为它们沿着管路的长度移动，气泡还可以通过产生湍流（bolus）来帮助混合，以及为操作人员提供快速、简单的流体流动特性的检查。样品溶液和标准溶液以完全相同的方式流经相同长度的反应管路，形成稳态，然后依据分光光度法原理进行测定。

1. 仪器组成

连续流动分析仪由进样器、泵管、蠕动泵、分析管路、检测器和信息采集处理系统构成（见图2-1）。每个模块完成一特定功能。

图2-1 简单的CFA分析系统

进样器是在蠕动泵的作用下将标准溶液或样品溶液依次引入化学反应模块的自动取样设备，取样量是由泵管的流量来确定的。吸取清洗液、标准溶液和样品溶液的顺序由信息采集处理系统事先编好的顺序确定。

泵管是连续流动分析实现化学反应的基础，不同内径泵管代表不同的流量，在设计反应管路时，往往要根据经典方法的试样量和反应试剂量的最佳配比，选择适宜流量的泵管，确保显色反应试剂过量和最佳反应条件。

蠕动泵是流体驱动系统的核心。由一个微型电机的主轴带动一组辊轴转动并断续挤压弹性泵管，利用所形成的负压吸取并推动液流，同时引入空气将液流分成等段的液节。当泵的转速一定时，每个泵管内液体的流速也一定。由于方法设计不同内径的泵管，各泵管输出的液体体积有一定比例（按最佳反应需要选择适宜内径的泵管），故蠕动泵也称比例泵。泵速可变，如清洗时速度加快可节省时间。

化学反应模块完成对样品的全自动预处理，是连续流动分析技术的核心。即实现样品与试剂在分析管路中进行的混合、透析、加热等处理，并在进入检测器前实现稳态完全反应。模块通常包括混合圈、渗析器、加热槽等，其中混合圈内反应物螺旋运动，加速高浓度和低浓度相互扩散混合，使片断流内的液体充分混合均匀；渗析器内的半透膜，只允许小分子通过，大分子物质不能或极少通过，以起到净化待测样品溶液的作用；加热槽可根据方法需要，当反应需要加热时，可用加热器来实现。此外，反应模块还可通过安装特殊装置实现在线蒸馏、在线紫外消化、在线溶剂萃取、离子交换等所有实验室经典样品处理手段。

检测器就是检测反应完全后的待测液通过流通池时的光强变化，并将光信号转变为电信号响应，不同的分析方法可选择合适的检测器进行测定。常用的检测器包括有分光光度计（波长范围340～900nm）、UV-分光光度计（波长范围190～900nm）、火焰光度计、荧光光度计等。

数据处理系统就是将检测器转变的电信号响应进行记录和数据处理，该系统能够连续监测分析系统的信号值并记录分析的结果，可自动补偿由于基线、灵敏度等原因引起的误差。典型连续流动分析谱图见图2-2，图中标准样品和样品的峰形为 “刀刃峰”。

图2-2 连续流动分析谱图

2. 连续流动分析的特点

连续流动分析仪是基于完全化学反应的基础，将繁琐的手工操作变成仪器简便的自动化操作，具有以下几个特点。

（1）检测精度高。高精度蠕动泵将样品、试剂及空气泡按确定的流量泵入系统中；试剂流中引入气泡，降低扩散与内部带过，降低了样品间的交叉污染，从而获得足够长的时间使反应完全；溶液中加入润滑剂，有效地防止了液体带流；采用渗透膜去除了基质中的干扰物质等。

（2）分析速度快。分析速率为60～150个样品/h，实现大批量样品的快速测定。

（3）完全自动化。自动进样，在线稀释、在线处理、自动校正、自动制作标准曲线、自动清洗管路等，使复杂的实际应用完全自动化，避免人工操作失误。

（4）操作相对安全。采用微流技术，试剂用量少，排出废液少；采用在线处理，避免了检测人员接触有害试剂的几率。

（5）每个分析通道100%独立。某个信道出现问题时，其他通道不受影响，可继续操作。