环介导基因恒温扩增技术介绍

环介导基因恒温扩增（LAMP）技术是一种崭新的DNA扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点，能代替PCR方法的最新技术。随着技术的不断完善和改进，其广泛应用于食品安全食源性致病微生物检测、医学诊断（包括重大传染性疾病诊断、代谢性疾病诊断和先天遗传性疾病诊断）、农产品、畜产品和水产养殖业致病微生物检测、转基因食品检测。广州华峰生物科技有限公司开发的相关检测产品在国内外处于领先水平，仅食源性致病检测试剂盒就包括阪崎肠杆菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、溶血链球菌L、志贺氏菌、布鲁氏菌、肺炎克雷伯氏菌、军团菌、溶藻弧菌、产气夹膜梭菌、副溶血弧菌、空肠弯曲杆菌、沙门菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森菌等。

环介导等温扩增法（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件（63℃左右）保温30～60min，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

LAMP与其他基因诊断技术比较如表5-16所示。

表5-16 LAMP与其他墓因诊断技术比较

1.LAMP法的试剂

IAMP法既可对DNA进行扩增，也可对RNA进行扩增：对DNA的扩增，需4种引物（FIP、F3、BIP、B3）、链置换活性DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）、底物（dNTP）及反应缓冲液；对RNA的扩增，则在DNA扩增的试剂的基础上，再加上逆转录酶即可。

2.LAMP法的引物

引物设计是LAMP法实现扩增的关键所在。各区段的设计规则与PCR相同，设计上应注意碱基构成、GC含量、次结构等因素。Tm值用毗邻法求得。此外还要注意：3′末端不可出现富AT结构，扩增区段F2～B2之间最好控制在200bp以内，包括F2/B2在内形成循环状部分的大小在30～90bp范围，如果只是为了检测目标基因存在与否，则可省略F1～B1之间的距离。FIP引物：正向内引物F2区段（与靶基因3′末端的F2c区段完全互补）和F1c区段（同靶基因3′末端F1c序列相同）；F3引物：正向外引物F3（与靶基因F3c区段完全互补）；BIP引物：反向内引物B2区段（与靶基因3′末端B2c序列完全相同）；B3引物：反向外引物B3（与靶基因B3c区段完全互补）。

黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureusRosenbach）是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属（Staphylococcus）。有“嗜肉菌”的别称。可引起许多严重感染。金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如乳、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位，常成为污染源。一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品：食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不密封，运输过程中受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。

（一）生物安全措施

为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测金黄色葡萄球菌，所有培养物和废弃物应参照GB 19489《实验室生物安全通用要求》中的有关规定执行。

（二）防污染措施

防止污染措施应符合GB/T 27403-2008《实验室质量控制规范食品分子生物学检测》的规定。

（三）缩略语

Betaine：甜菜碱

Bst酶：BstDNA polymerase（large fragment），BstDNA聚合酶（大片段）

dNTP：deoxyribonucleoside tripHospHate，脱氧核苷三磷酸

femA：金黄色葡萄球菌的甲氧苯青霉素（methicillin）耐药有关的基因

LAMP：loop－mediated isothermal amplification，环介导恒温扩增

Triton X－100：聚乙二醇辛基苯基醚

（四）实验原理

根据金黄色葡萄球菌特有的靶序列femA基因设计的两对特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上的六个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在femA基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎－环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。

（五）试剂和材料

除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T 6682中一级水的要求。

1.引物

根据金黄色葡萄球菌特有的靶序列femA基因设计一套特异性引物，包括外引物1（F3），外引物2（B3），内引物1（FIP），内引物2（BIP）。

外引物扩增片段长度：231bp。

F3（5′－3′）：TTTAACAGCTAAAGAGTTTGGT

B3（5′－3′）：TTTTCATAATCRATCACTGGAC

FIP（5′－3′）：CCTTCAGCAAGCTTTAACTCATAGTTTTTCAGATAGCATGCCATACAGTC

BIP（5′－3′）：ACAATAATAACGAGGTYATTGCAGCTTTTCTTGAACACTTTCATAACAGGTAC

2.10×ThermoPol缓冲液

含：0.2mol/L Tris－HCl，0.1mol/L KCl，0.1mol/L（NH₄）₂SO₄，20mmol/L MgSO₄，1%TritonX－100。

3.dNTPs

每种核苷酸浓度10mmol/L。

4.甜菜碱浓度：5mol/L；硫酸镁（MgSO₄）浓度：150mmol/L。

5.Bst DNA聚合酶

酶浓度8U/μL。

6.DNA提取液

20mmol/L Tris HCl，2mmol/L EDTA，1.2% Triton X－100（pH8.0）。

7.显色液

SYBR Green Ⅰ荧光染料，1000×。

8.阳性对照

金黄色葡萄球菌标准菌株，或含目的片段的DNA。

9.1.5mL塑料离心管。

10.金黄色葡萄球菌LAMP检测试剂盒1，可选，参照试剂盒说明书操作。

（1）试剂盒组成

每个试剂盒（20T/kit，每个反应体系体积为25μL）组成如表5-17所示。

表5-17 金黄色葡萄球菌LAMP检测试剂盒组成

（2）试剂盒注意事项说明

①试剂盒内各试剂使用前，充分融化后稍离心。

②试剂盒内的阳性对照应视为具有污染性物质，应注意避免污染其他样品和反应试剂，导致错误检验结果。

（3）金黄色葡萄球菌femA基因序列

①金黄色葡萄球菌femA基因序列（accession no. AF144661）

1 atgaagttta caaatttaac agctaaagag tttggtgcct ttacagatag catgccatac

61 agtcatttca cgcaaactgt tggccactat gagttaaagc ttgctgaaggttatgaaaca

121 catttagtgg gaataaagaa caataataac gaggtcattgcagcttgctt acttactgct

181gtacctgtta tgaaagtgtt caagtatttt tattcaaatc gcggtccagt gatcgattat

241gaaaatcaag aactcgtaca ctttttcttt aatgaattat caaaatatgt taaaaaacat

301 cgttgtctat acctacatat cgatccatat ttaccatatc aatacttgaa tcatgatggc

361 gagattacag gtaatgctgg taatggttgg ttctttgata aaatgagtaa cttaggattt

421 gaacatactg gattccataa aggatttgat cctgtgctac aaattcgtta tcactcagtg

481 ttagatttaa aagataaaac agcagatgac atcattaaaa atatggatgg acttagaaaa(www.xing528.com)

541 agaaacacga aaaaagttaa aaagaatggt gttaaagtaa gatatttatc tgaagaagaa

601 ctaccaattt ttagatcatt catggaagat acgtcagaat caaaagcttt tgctgatcgt

661 gatgacaagt tttattacaa tcgcttaaaa tattacaaag accgtgtgtt agtgccttta

721 gcgtatatca attttgatga atatattaaa gaactaaatg aagagcgtga tattttaaac

781 aaagatttaa ataaagcatt aaaggatatt gaaaaacgtc ctgaaaacaa aaaagcgcat

841 aacaagcgag ataacttaca acaacaactt gatgcaaatg agcaaaagat tgaagaaggt

901 aaacgtctac aagaagaaca tggtaatgaa ttacctatct ctgctggttt cttctttatc

961 aatccatttg aagttgttta ttatgctggt ggtacatcaa atgctttccg tcattttgcc

1021 ggaagttatg cagtgcaatg ggaaatgatt aattatgcat taaatcatgg cattgaccgt

1081 tataatttct atggtgttag tggtaaattt actgaagatg ctgaagatgc tggtgtagtt

1141 aaattcaaaa aaggttacaa tgctgaaatt attgaatatg ttggtgactt tattaaacca

1201 agtaataaac ctgtttacac agcatatacc gcacttaaaa aagttaaaga cagaattttt

1261 tag

注：下划线所示部分为引物扩增匹配区段。

②组成引物中碱基构成：

femA－F3：TTTAACAGCTAAAGAGTTTGGT

femA－B3：TTTTCATAATCRATCACTGGAC

注：其中阴影部分TTTT为连接序列；引物中“Y”代表碱基“T”和“C”。

（六）仪器和设备

①移液器：量程0.5～10μL；量程10～100μL；量程100～1000μL。

②高速台式离心机：≥7000×g。

③水浴锅或加热模块，（65±1）℃和（100±1）℃。

④恒温培养箱：（36±1）℃；均质器；计时器。

（七）检测程序

食品中金黄色葡萄球菌LAMP检测程序如图5-6所示。

（八）操作步骤

采用以下方法，也可使用金黄色葡萄球菌LAMP检测试剂盒按照说明书操作。

1.样品制备、增菌培养

按照GB/T 4789.10方法进行样品制备和增菌。具体操作如下：

（1）样品稀释 固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000～10000r/min均质1～2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1∶10的样品匀液。

液体样品：以无菌移液管吸取25mL样品至盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。

（2）增菌和分离培养 吸取5mL上述样品匀液，接种于50mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤培养基内，（36±1）℃培养18～24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤呈混浊生长。

图5-6 食品中金黄色葡萄球菌LAMP检测程序

将上述培养物，分别划线接种到Baird－Parker平板或血平板，血平板（36±1）℃培养18～24h。Baird－Parker平板（36±1）℃培养18～24h或45～48h。

金黄色葡萄球菌在Baird－Parker平板上，菌落直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为混浊带，在其外层有一个透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大、圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。

2.细菌模板DNA的制备

采用下述方法，也可使用等效的商品化的DNA提取试剂盒并按其说明提取制备模板DNA。

（1）增菌液模板DNA的制备

①取上述增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，7000×g离心2min，尽量吸弃上清液。

②加入80μL DNA提取液，混匀后沸水浴15min，置冰上10min。

③7000×g离心2min，上清液即为模板DNA；取上清液置－20℃可保存6个月，备用。

（2）可疑菌落模板DNA的制备

对于上述分离到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，再加入80μL DNA提取液，同上制备模板DNA以待检测。

3.环介导恒温核酸扩增

（1）反应体系 金黄色葡萄球菌LAMP反应体系如表5-18所示。

表5-18 金黄色葡萄球菌LAMP反应体系

（2）反应过程

①按表5-18所述配制反应体系。

②65℃温育60min。

（3）空白对照、阴性对照、阳性对照设置 每次反应必须设置阴性对照、空白对照和阳性对照。

空白对照设为以水替代DNA模板。

阴性对照以DNA提取液代替模板DNA。也可使用金黄色葡萄球菌LAMP检测试剂盒中的阴性对照。

阳性对照制备：将金黄色葡萄球菌标准菌株接种于营养肉汤中（36±1）℃培养18～24h，用无菌生理盐水稀释至10⁶～10⁸CFU/mL（约麦氏浊度0.4），按前述模板DNA的制备方法提取模板DNA作为LAMP反应的模板。也可使用金黄色葡萄球菌LAMP检测试剂盒中的阳性对照。

4.结果观察

在上述反应管中加入2μL显色液，轻轻混匀并在黑色背景下观察。

建议使用LAMP试剂盒专用反应管，将反应液和显色液一次性加入，DNA扩增反应后可不必开盖即可观察结果。

5.结果判定

在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：

（1）待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为金黄色葡萄球菌初筛阳性，对样品的增菌液或可疑纯菌落进一步按GB/T 4789.10中操作步骤进行确认后报告结果。

（2）待检样品反应管液体呈橙色则可报告金黄色葡萄球菌检验结果为阴性。

若与上述条件不符，则本次检测结果无效，应更换试剂按本方法重新检测。

相关试剂盒可由广州华峰生物科技有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。