PCR检测技术概述

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是发展和普及最迅速的分子生物学新技术之一。PCR技术在发展和实际应用中衍生出许多改良技术，如RT－PCR（Reverse Transcription－PCR），PCR－RFLP（PCR－Restriction Fragment length Polymorphism），多重PCR（Multiple primer－PCR），不对称PCR（Asymmetric PCR），P皇家CR－SSCP（Single Strand Conformational Polymorphism），PCR－ASO（Allela Specific Oligonucleitides），RAPD－PCR（Random Amplified Polymorphic DNA），错配PCR（Mismatched PCR），原位PCR（in Situ PCR），实时荧光定量PCR（Real－time Quantitative PCR），DDRT－PCR（Differential Display RT－PCR），免疫PCR等。

（一）PCR原理

PCR是依据DNA模板的特性，模仿体内的复制过程，在体外合适的条件下以单链DNA为模板，以人工设计和合成的寡核苷酸为引物，利用热稳定的DNA聚合酶延5′—3′方向掺入单核苷酸来特异性的扩增DNA片段的技术。整个反应过程通常由20～40个PCR循环组成，每个循环由高温变性—低温复性（退火）—适温延伸三个步骤组成：高温时DNA变性，氢键打开，双键变成单键，作为DNA扩增的模板；低温时寡核苷酸引物与单链DNA模板特异性的互补结合即复性；然后在适宜的温度下DNA聚合酶以单链DNA为模板沿5′－3′方向掺入单核苷酸，使引物延伸合成模板的互补链，经过多个变性—退火—延伸的PCR循环，就使得DNA片段得到有效的扩增，通常情况下单一拷贝的基因经过25～30个循环可扩增100万～200万个拷贝。

最初的PCR是用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段进行，但Klenow片段在高温下迅速失活，因此每一份反应都需要加一份新酶，这不仅麻烦，而且还往往导致产量低，出现产物长短不一等现象。以后人们采用从嗜热细菌分离的耐热TaqDNA聚合酶才解决了这一问题，现在天然的TaqDNA聚合酶或经基因工程重组生产的TaqDNA聚合酶在高温下都很稳定，故在整个过程中不需要添加新的TaqDNA聚合酶，从而使PCR技术迅速发展起来。

（二）PCR反应体系

PCR反应体系主要由引物、dNTP、DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）、缓冲液、Mg²⁺和核酸模板组成。

1.引物

引物是与待扩增DNA片段两侧互补的寡核苷酸，是决定PCR扩增特异性的因素，引物设计和合成的好坏直接决定PCR扩增的成败。

通常情况下设计PCR引物应遵循以下原则：

（1）通常要求引物位于待分析基因组中的高度保守区域，长度至少为16个核苷酸，以20～24个核苷酸为宜，这种长度的引物在聚合温度下（通常为72℃）不能形成十分稳定的杂交体。由于在低温下（37～55℃）TaqDNA聚合酶也能作用，所以当寡核苷酸引物退火结合到模板上后，TaqDNA聚合酶就马上开始工作（但TaqDNA聚合酶在低温下工作非常缓慢）；当反应的温度升至72℃时，延伸后的产物已经足够长，所以能稳定地结合在模板上。引物的T_m值可按式（5-7）进行计算：

式中 G+C和A+T——碱基数。

（2）引物中的碱基应当随机分布，避免在引物中出现一些单一的碱基重复序列，引物内不能形成发夹结构或产生具有二级结构的区域，引物间不能互补，引物中G+C含量约为45%～55%。

（3）在引物5′末端可加入限制酶切位点序列以便进行克隆。在酶切位点5′末端还应加上适当数量的保护碱基，以保证扩增反应产物克隆后能够被酶切。如果要使PCR产物能够直接被限制酶切割，则在设计引物的两端应稍多加几个保护碱基，否则不易切断，如表5-5所示，比较了各种限制内切酶在其酶切位点旁边分别加0、1、2、3个保护碱基后的切断情况。寡核苷酸5′末端应含有少量不配对碱基，通常并不影响其作为引物的能力。

表5-5 PCR产物末端限制性酶切位点的切断情况

续表

注：－为不能切断；±为不能完全切断；+为能完全切断。

（4）引物3′末端对TaqDNA聚合酶的延伸效率影响很大。实验表明在扩增HIV（人免疫缺陷病毒）时不同的引物3′末端最末一个碱基的错配对扩增效率影响不同，一般引物3′末端最好选T，不要选A、G和C。设计简并引物时3′末端的简并性应尽量小。

表5-6 引物3＇末端最末一个碱墓错配时的扩增效率

在设计中还应注意上下游两种引物的3′端之间应避免出现互补序列，否则扩增产物中会出现大量的引物二聚体。如无法避免这种互补序列，应通过预备实验适当调节Mg²⁺浓度以获得较多的目的产物。

（5）引物间的T_m值应尽可能接近，GC含量不能太高。

按上述这些原则设计的引物通常能够获得较好的结果。

在使用引物进行扩增反应时要注意所使用的引物浓度，一般引物浓度为1.0μmol/L，这种浓度通常足以进行30轮以上的扩增反应，更高的引物浓度会在异位引导合成，从而扩增那些不需要的序列；相反若引物浓度不足，则PCR反应的效率极低。根据不同反应的需要，上下游两种引物的浓度可以相等，也可以不等。

2.dNTP

dNTP是PCR反应所必需的底物，为四种核苷酸的混合物。当四种核苷酸的浓度相同时可将核苷酸的错误掺入率降至最低。最适宜的dNTP终浓度应根据被扩增片段的长度和碱基组成来确定。一般使用的浓度为0.2mol/L。

3.DNA聚合酶

目前PCR扩增中最常用的DNA聚合酶是TaqDNA聚合酶，它是由水生栖热菌（Thermus aquaticus）产生，热稳定性好，可耐94℃高温，在此温度下短时间内对活力无多大影响。最适反应温度为72℃，70℃催化核酸链延长的速度是2800核苷酸/min，在100μL反应体系中一般用2单位，它的用量多少对PCR扩增效率及特异性有一定影响。除了TaqDNA聚合酶外，近年来耐热的pfuDNA聚合酶也被广泛地用于PCR反应，此酶是由极端嗜热的激烈热球菌（Pyrococcus furiosus）产生的DNA聚合酶，是迄今发现的掺入错误率最低的耐热DNA聚合酶，但其延伸速度比TaqDNA聚合酶低550核苷酸/min；另外得到应用的还有一种rTthDNA聚合酶，由于PCR反应以DNA模板进行扩增反应，而rTthDNA聚合酶可将反转录和聚合作用融合在一起，直接由其将RNA反转录后扩增出大量的DNA片段，因而可大大简化操作程序，提高效率。

现在市售的TaqDNA聚合酶的活力因生产厂家不同而有所不同，应根据厂家推荐的用量添加。一般100μL反应液中加1单位的TaqDNA聚合酶即足以进行30轮扩增反应。所用的酶量可根据所扩增的DNA、引物和其他因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使非特异性产物增加；而酶量过少会使目的产物的产量减少。

TaqDNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错率约为2.5×10⁴核苷酸/每轮循环，因此以PCR获得的克隆进行测序时应注意分析由几次不同PCR克隆所得到的序列，以免出错。

TaqDNA聚合酶往往会在DNA链3′末端加上非模板互补核苷酸，从而产生不易克隆的PCR产物。通过用其他DNA聚合酶（如T4DNA聚合酶）处理扩增产物，补平或除去突出末端可解决这一问题。

4.反应缓冲液

PCR反应中常用的反应缓冲液含10～50mmol/L（pH8.3～8.8）的Tris－HCl，50mmol/L KCl和1.5mmol/L MgCl₂。反应缓冲液的pH至关重要，如果KCl浓度过高，则会抑制酶的活性。在反应中存在适当浓度的Mg²⁺至关重要，它是TaqDNA聚合酶活力所必需的，并可影响PCR产物的特异性和产量、引物退火的程度、模板与PCR产物链的解离温度、引物的特异性、引物二聚体的形成以及酶的活性和精确性等。由于EDTA或磷酸根能影响Mg²⁺的浓度，所以应注意模板DNA溶液中的EDTA浓度和PCR反应中所加模板和引物的量以及dNTP浓度（dNTP可提供磷酸基团，从而影响Mg²⁺浓度）。要获得最佳反应结果，必须选择合适的Mg²⁺浓度，一般为2～5mmol/L。

5.核酸模板

以细菌为例作为模板的DNA可以是染色体DNA，也可以是质粒DNA；既可以是单链DNA分子，也可以是双链DNA分子；既可以为线性DNA分子，也可以为环形DNA分子。当以染色体DNA作为模板进行PCR扩增时所需的TaqDNA聚合酶量较高。通常PCR反应体系中所需的模板的量是10²～10³拷贝的靶序列。DNA模板量过多会降低扩增的效率，增加非特异性产物。在所加的模板DNA中目的序列所占的比例越高，非特异性产物的量就越少。

DNA制品中的杂质也会影响PCR反应的扩增效率。这些杂质包括尿素、SDS、甲酰胺、乙酸钠、从琼脂糖凝胶中带来的杂质等。用酚∶氯仿抽提，然后在2.5mol/L乙酸铵存在下用乙醇沉淀或用聚丙烯酰胺凝胶代替琼脂糖凝胶可减少上述杂质所造成的影响。

6.其他成分

原先在使用Klenow片段进行的PCR反应中，需要加DMSO防止聚合酶提前从合成链上脱落。现在在某些使用TaqDNA聚合酶进行的反应中也可加3%～10%的DMSO，因为它可减少核酸的二级结构，对扩增GC含量较高的DNA有帮助，但高浓度DMSO会抑制TaqDNA聚合酶的活力，当其浓度超过10%时会使TaqDNA聚合酶的活性减少50%，因此现在进行PCR扩增时一般不加DMSO。反应中还可加明胶（0.1mg/mL）、BSA（0.1mg/mL）或非离子去污剂（0.5%，如吐温20或NP－40），它们可稳定TaqDNA聚合酶，但许多反应不加这类物质也可获得良好的结果。

一般反应中还应加矿物油以防止反应在扩增过程中加热蒸发而产生的问题。有一种PCR扩增仪可使反应管盖上方的温度维持在105℃，因此可防止管中的液体向上蒸发，所以反应过程中不必添加矿物油。

（三）PCR反应参数

在PCR反应中每轮循环的各步反应时间不应过长，以免降低TaqDNA聚合酶的活力。下面介绍PCR反应中的一些具体参数。

1.变性

在第一轮扩增前使DNA完全变性十分重要，因此一般反应中都先在94℃变性5min，然后再加入TaqDNA聚合酶进行扩增。变性不完全往往使PCR反应失败，因为未完全变性的DNA会很快复性，减少DNA的产量。DNA变性一般仅需要几秒钟即可完成，反应中变性所需的时间主要是为使整个反应体系达到合适的变性温度。变性时温度过高或时间过长，都会导致酶活力的降低。TaqDNA聚合酶活力的半衰期为：92.5℃，130min；95℃，40min；97℃，5min。典型的变性温度和时间为94℃，1min或97℃，15s。

2.退火

引物退火温度和所需时间长短取决于引物的碱基组成、引物的长度、引物与模板的匹配程度以及引物的浓度。实际使用的退火温度比扩增引物的T_m值约低5℃。一般当引物中GC含量较高，长度较长并且与模板完全匹配，则应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性也越高。有些反应甚至将退火和延伸反应合并，只用两种温度完成整个扩增循环（例如用60℃和94℃），这既节省了时间，又提高了特异性。

在典型的引物浓度（0.2mol/L）下，由于引物过量，退火仅需数秒钟即可完成。反应中所需的退火时间主要是为了使整个反应体系达到合适的温度。典型的退火温度和时间为50℃和2min。

3.延伸

延伸反应通常在72℃下进行，接近TaqDNA聚合酶的最适反应温度75℃，实际上引物延伸在退火时已经开始，因为TaqDNA聚合酶的作用温度范围为20～85℃，延伸反应时间的长短取决于目的序列的浓度和长度。在一般反应体系中TaqDNA聚合酶每分钟可合成1kb长的DNA。对于极长的片段延伸时间可达15min，但使用更长的时间则对扩增产物已没有影响。在能完成DNA合成的前提下应尽量缩短延伸反应的时间以减少TaqDNA聚合酶活力的降低。典型延伸反应的温度和时间为72℃和1～3min。一般在扩增反应完成后都需要有一步长时间（通常为10～30min）的延伸反应，以获得尽可能完整的扩增产物，这对以后进行克隆和扩增产物测序极为重要。

4.循环次数

当其他参数确定之后循环次数主要取决于模板DNA的浓度，一般而言25～30轮循环已经足够。循环次数过多，会使PCR产物严重出错，非特异性产物大量增加。一般经25～30轮循环后，DNA聚合酶已经严重不足，不能进行扩增，如果此时产物产量还不够，需要进一步扩增，则可将扩增的DNA样品稀释10³～10⁵倍作为模板，重新加入各种反应底物进行扩增反应。这样经60轮循环，扩增水平可达10⁹～10¹⁰，但要注意此时非特异性产物的量也会大量增加。不同起始目的DNA分子数与所用的PCR循环次数的关系如表5-7所示。

表5-7 起始目的D NA分子数与所用的PCR循环次数的关系

在扩增反应后期合成产物的量达0.3～1pmol时，由于产物积累使原来以指数扩增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环次数而明显上升，这称为平台效应。平台效应取决于下列因素：①尚可利用的底物浓度（dNTP或引物浓度）；②反应中存在的酶活力；③最终产物的反馈抑制（焦磷酸或双链DNA）；④非特异性产物或引物二聚体与反应模板的竞争；⑤在高浓度产物下产物的变性和链分离不能完全，或者大量特异性产物重新退火（从而降低有效的模板数或者使延伸反应出错）；另外平台期会出现原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增达到较高水平。因此适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物出现。现在有一种PCR只需10多分钟即可完成20轮循环，它利用热传递很快的毛细管，减少了反应中为使整个反应体系达到合适温度所需要的时间，从而提高反应效率。

（四）常见PCR种类

1.热启动PCR

原理和特点：在传统PCR反应中除一种主要反应试剂（dNTP或TaqDNA聚合酶或引物外），其他反应成分一次性加入，当程序性升温达到70℃以上时再将反应管放在PCR扩增仪上进行扩增，这样既可以减少非特异性扩增产物的出现，又可以减少引物二聚体的形成。

2.一步单管PCR

该方法主要用于RN A病毒等的检测，一种方法是首先用化学方法提取核酸，接下来将cDNA及PCR反应放在一个反应管中，在PCR扩增仪上一步进行。近年来又有人将热裂解释放核酸方法用于提取病毒RNA提取，使RNA的提取、反转录和PCR在一个反应管中一步进行，这样既减少了操作步骤，又最大限度地减少了环境核酸和核酸酶造成的污染，使特异性及敏感性都有所增加。

3.多重PCR

多重PCR原理与常规PCR相同，只是在反应体系中加入一对以上的特异性引物，如果存在与特异性引物对互补的模板，则可同时在同一个反应管中扩增出一条以上的DNA片段，这种方法既保留了常规PCR的特异性、敏感性，又减少了操作步骤及试剂，实现了一次扩增就能同时检测多种微生物的目的。

4.依赖PCR的DNA指纹图谱技术

通过各种改进的PCR技术使目标微生物的核酸经扩增后产生多条DNA扩增片段（包括特异性的和非特异性的），通过统计分析找出某种微生物的特有条带进行区别鉴定。其特点是即使在事先不知道目的微生物核酸序列的前提下，也可以对其进行检测和鉴定。

5.PCR－单链构象多态性分析

1989年才真正建立起PCR－单链构象多态性分析技术，一般用于基因突变的检测，主要用于癌基因或抗癌基因的检测分析。在微生物检测方面只有Wdjoioatmodjo等1994年将其用于细菌的快速鉴定，他们采用两对保守引物分别用于16SrRNA基因两侧，产物为216bp和255bp的基因片段，扩增检测了15个属40个种的100多个代表菌株，能较好地将这些菌分离开来，产物检测时需要注意电泳温度和电泳缓冲液离子强度的变化：该方法灵敏度更高，可检测到只有一个碱基的突变和差异；不需要酶切，直接对产物进行随机多态性分析，操作简便，无需专门仪器。

6.mRNA差异显示技术

mRNA差异显示技术主要用于真核细胞mRNA差异的表达，为寻找未知基因提供了新途径，但将其应用于未知微生物的检测和鉴定目前尚未报道。

7.随机引物扩增DNA多态性（RAPD）

这种技术主要用于在不考虑微生物核酸精确序列的前提下比较微生物间的DNA指纹图谱差异，具有种特异性和同种不同株间的特异性，且重复性较好。RAPD技术近年来已被广泛用于细菌种间的鉴定；此外该技术也被用于真菌和酵母等的检测与鉴定，RAPD技术的关键是引物的筛选和实验条件的优化。

8.以微卫星DNA介导的PCR技术

微卫星DNA又称简单重复序列，它广泛存在于原核和真核生物基因组中，其中最常见的是双核苷酸重复，即（AC）n和（TG）n，该技术可作为RAPD技术的一个特例，区别在于其引物不是完全随机的，因此扩增引物的条带组成比RAPD的要稳定。目前这一技术已被用于真菌等的检测，但用于其他微生物的分型和检测尚未见报道。

9.基因间重复性回文片段（REP）和基因内重复性一致序列（ERIC）的扩增

Versalovic以与REP和ERIC重复序列配对互补的寡核苷酸片段作为PCR扩增的引物及斑点杂交的探针来检测真细菌属中的不同菌，包括大肠杆菌、布鲁杆菌和假单孢菌等，扩增产物在琼脂糖凝胶上形成清晰的DNA条带，而且在不同的真细菌属、种之间都存在特异的DNA指纹图谱。除引物序列固定外，其他与RAPD一致，且结果的重复性更好。

10.扩增片段长度多态性分析（AFLP）

1995年Vos等建立了这一技术并将其用于 λDNA、植物病毒DNA、细菌DNA及植物DNA等的检测，结果较好。要想得到有价值的图谱，选择合适的核酸内切酶是关键。该法与RAPD等技术相比，具有稳定性高，重复性好等优点。目前尚未见进一步报道。

11.限制性长度多态性分析（RFLP）

此方法基于在PCR扩增产物的片段内含有限制性酶切位点，扩增产物经酶切后在电泳凝胶上可分出特定的条带。若酶切位点发生变异，则不能被酶切，电泳图谱将发生改变，以此可对微生物进行检测和分型。只要待扩增片段选择得当，则扩增产物图谱重复性较好，否则若变异点不在酶切位点，其区分能力就受到限制或完全丧失。Selenska－Pobell等对RELP技术、RAPD技术及肠道细菌重复性回文片段扩增技术进行了比较。在检测根瘤菌方面，后两种技术具有较明显的优势：简单、快速且分辨率较高。

12.用于RNA病毒检测的核酸扩增技术

TthDNA聚合酶介导的核酸扩增技术：TthDNA聚合酶来源于嗜热真菌，为一耐热的DNA聚合酶，此酶为一高度加工的5′—3′聚合酶，不仅有与TaqDNA聚合酶同样的DNA聚合作用，而且具有反转录活性。利用其这种特性可以对其RNA病毒进行检测。

目前微生物的分子生物学检验主要采用改进的PCR技术，尤其是DNA指纹图谱技术近年来得到了快速发展。对于一种未知微生物一般应先采用通用引物多重PCR技术鉴定出种、属，再用DNA指纹图谱技术进一步分型，同时应用这一技术还有可能发现新的未知微生物。

（五）PCR技术用于检测的主要步骤

（1）运用化学手段对目标DNA进行提取。

（2）设计并合成引物，引物设计或合成的好坏直接决定PCR扩增的成效。

（3）进行PCR扩增。

（4）克隆并筛选鉴定PCR产物，将扩增产物进行电泳、染色，在紫外光照射下可见扩增特异区段的DNA带，根据该带的不同即可鉴定不同的DNA。

（5）DNA序列分析不同的对象，如扩增DNA片段序列全知、半知或未知，其PCR参数、退火温度、时间和引物等都有较大的差别，部分更组合了RFLP、Sequence和反转录PCR等技术，形成了众多的衍生技术，如多重PCR、定量PCR、竞争PCR单链构型多态性PCR、巢式PCR等，这些技术使PCR在食品中的应用潜力更广。

（六）PCR反应的注意事项

由于PCR反应灵敏度非常高，所以PCR反应中通常应注意下列事项：

（1）准备自己的一套试剂，并少量分装贮藏在无菌工作台附近的专用冰箱内，这些试剂不要挪作他用。配制试剂时应使用未与实验室中其他DNA接触的新玻璃器皿，塑料器皿和移液器、分装的试剂用后即应丢弃，不要重新贮藏。

（2）如有可能应在装有紫外灯的无菌操作台中准备和进行PCR。无论何时只要无菌操作台不用，就应打开紫外灯。并将微型离心机、一次性手套、各种用具及用于PCR的各种移液器全部都放在无菌操作台内。由于微量可调移液器的套筒部分往往是污染源，因此应该用带一次性吸头和活塞的正置换移液器吸取试剂。所有缓冲液、移液器吸头及离心管在使用前都应高压灭菌。

（3）在打开装有PCR试剂的小离心管前，先用无菌操作台中的微量离心机短促离心10s，使液体沉到离心管底部以减少手套和移液器污染的可能性。

（4）在加模板DNA之前最好先将所有其他反应成分加入到微型离心管中，包括加入防止蒸发的矿物油，最后再加入模板DNA，盖好离心管，用戴手套手指轻轻弹打离心管中壁，混合溶液短促离心10s，使有机相与水相分开，然后进行PCR。

（5）只要可能应设立一个正对照（即含少量合适目的序列的PCR），应预先在实验室其他地方准备一份适当稀释的目的序列溶液，以避免将目的DNA的浓溶液带到专门进行PCR的工作区内。同时应设立除模板之外含所有PCR成分的负对照，以便检查反应中是否存在污染的DNA。

在工作中经常遇到上一次实验扩增的产物污染下一次扩增反应的情况，利用Perkin Elmer Cetus公司的carryover prevention试剂盒可防止这种污染。该试剂盒的工作原理如下：用dUTP代替dTTP进行反应，因为TaqDNA聚合酶同样能利用dUTP进行合成反应，使所得产物中含有dUTP，这种含有dUTP的产物与含dTTP的产物一样可进行杂交、克隆或其他反应，使来自上一轮反应的污染DNA被降解除去。由于UNG作用于单链或双链DNA中的dU，对其他反应底物（包括RNA链中的U和底物中的dUTP）都没有影响，故扩增反应仍可进行。

（七）PCR技术在转基因食品检测中的应用

PCR技术具有特异、灵敏、自动化、快捷等优点，使其在食品检验中发挥着重要作用，并且有着巨大的发展潜力。目前PCR技术在食品检验中可用于食源性致病菌检测（如沙门菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌等的检验）、益生菌检测（如对乳酸菌菌种的鉴定和鉴别等）、动物源性成分检测（如对各类肉制品检测的靶基因主要为真核生物18S rRNA基因和线粒体细胞色素b基因等）、食品真伪鉴定（如通过鉴定大米内参基因而判断蜂蜜中是否掺入大米糖浆等）、食品过敏原成分检测（选取物种特异性基因作为靶基因，如编码大豆植物凝集素Lectin基因、编码玉米植物醇溶蛋白ZEIN基因等）、转基因食品检测等方面，以下就PCR技术在转基因食品检测中的应用进行举例介绍。

转基因食品又称遗传修饰食品（genetically modified food），简称GMF或GM食品。转基因产品的安全性一直是世界各国及联合国等国际组织关心的焦点，据统计，全世界36个国家和地区出台了各种转基因产品有关的法律法规，转基因产品的研究、生产、销售都要求在政府有关部门的许可和监督下，在特定的环境和地点进行。对转基因产品的检测管理越来越严格。

PCR技术是目前转基因食品检测的主要方法。利用与外源基因序列互补的特定引物对转基因食品中的外源DNA序列进行PCR扩增后分析，不仅可以对转基因食品进行定性鉴别，改良后也可以对转基因成分进行定量分析。

1.PCR技术对转基因食品的定性检测

目前基于GMO特异外源DNA片段的定性PCR筛选方法已广泛应用于转基因生物及食品的检测，一些国家将此作为本国有关食品法规的标准检验方法。

PCR检测转基因食品的基本步骤：①待检材料DNA提取：通常利用CTAB法从食品材料中提取核酸；②PCR反应：设计合适引物，PCR扩增待检样品中的靶标DNA；③观测PCR产物：通过凝胶电泳分析将PCR产物展现；④确定结果：有时为了避免假阳性，还需要对PCR产物进行限制性酶切分析进行质量控制。如采用一对引物5′－CCG ACA GTG GTC CCA AAG ATG GAC－3′和5′－ATA TAG AGG AAG GGT CTT GCG AAG G－3′扩增CaMV35 S启动子获得162bp产物，用EcoRV酶切可得到98和64bp两个片段；采用一对引物5′－GAA TCC TGT TGC CGG TCT TGC GAT G－3′和5′－TCG CGT ATT AAA TGT ATA ATT GCG GGA CTC－3′扩增nos终止子获得146bp产物，利用AflIII酶切可得到72bp和74bp两个片段。如酶切产物与预计片段大小一致可确定食品中含有转基因成分。

PCR检测转基因食品的优点：灵敏度高，检测迅速；无论外源基因在受体生物中是否表达，只要其DNA存在，就能被检测，同时适用于加工过的转基因食品；基于启动子和终止子调控序列的检测方法无须了解产品的转基因背景即可对其进行是否含有转基因成分进行筛选鉴定。

PCR检测转基因食品的局限性和缺点：①操作程序烦琐，需要对样品DNA进行提取，对某些材料可能出现假阳性。有些植物和土壤微生物含有CaMV35 S启动子或nos终止子容易造成假阳性结果。十字花科植物如油菜易自然感染CaMV病毒，如对进口转基因油菜针对35 S设计引物进行检测，则可能将感染病毒的非转基因油菜判定为转基因产品从而引起贸易纠纷。此外，由于PCR检测极为灵敏，整个操作过程极为严格，检测时容易遭到污染而出现假阳性结果，如离心管、移液器等器皿污染，或转基因样品对非转基因样品的交叉污染等。②易出现假阴性。随着转基因食品商品化进程加快，越来越多的目的基因将被导入更多的食品作物中，使用的启动子和终止子的种类将不再局限于目前几种，因此常规的PCR检测可能越来越多地出现假阴性。转基因食品中作为待检模板的核酸可能在食品加工处理过程中遭到降解或破坏，从而不能被检测而出现假阴性结果，此外转基因样品DNA提取质量不高时常因含有PCR反应抑制物而出现假阴性。③PCR检测大部分情况下只能检测1种目标分子，在少数情况下能同时检测2到3种目标分子，不能高通量大规模对进出口产品进行检测。

2.PCR技术对转基因食品的定量检测

目前基于GMO特异DNA片段的定性PCR筛选方法已广泛应用于GMO食品检测，但是随着各国有关GMO标签法的建立和不断完善，对食品中的GMO含量的下限已有所规定。为此，研究者在定性筛选PCR方法的基础上发展了不同的定量GMO的PCR检测方法。目前，国外较为成熟的方法主要有半定量PCR法、定量竞争PCR和实时荧光定量PCR等。

（1）半定量PCR法 PCR反应具有高度特异性和敏感性，只需对少量的DNA进行测定便可检测GMO成分，但对实验技术的要求很高，其结果易受许多因素的干扰而产生误差，如操作人员移液时的误差、器皿用品的交叉污染等，还有PCR反应体系存在的抑制因素也可带来干扰，一般PCR只用作转基因是食品的定性筛选检测。针对所存在问题，研究人员在实验设计中引入内部参照反应，以消除检测时的干扰，并与已知含量的系列GMO标准样的PCR结果进行比较，从而可以半定量地检测待测样品的GMO含量。

（2）定量竞争PCR法 PCR反应实质是对特定模板DNA的指数扩增放大，而在相同的条件下，获得DNA的量与最初模板DNA的浓度呈正相关，竞争定量PCR就是依据这种扩增DNA与模板DNA之间的浓度相关性设计的。基本原理是先构建含有修饰过的内部标准DNA片段（竞争DNA），竞争DNA由质粒组成，带有一个改造PCR扩增子，改造部分可以是DNA插入序列、缺失序列或者点突变，竞争DNA与待测目标DNA在同一反应管中进行PCR共扩增，因竞争DNA片段和待测DNA的大小不同，经琼脂糖凝胶可将两者分开，同过比较两种条带的量可进行定量分析。

（3）实时荧光定量PCR此方法在PCR反应体系中加入分别在其5′和3′互补的一个内部核酸探针，该探针5′端标记有荧光剂，3′端淬灭剂。PCR反应前，新的核酸链没有合成，探针的5′端和3′端互补形成双链，荧光剂和淬灭剂的位置相近，荧光剂发出的荧光被淬灭剂淬灭，检测不到荧光信号。PCR反应开始后，退火时，探针与模板杂交，在新链延伸过程中，通过TaqDNA聚合酶5｀核酸外切酶活力切下已杂交探针的5′端荧光剂标记，使荧光剂释放而发荧光，产生的荧光可被内设的激光器记录，记录到的荧光强度增加值与PCR的产物量成正比，而在一定PCR扩增循环次数范围内，PCR产物量与反应体系中的初始模板量成一定比例，因此通过系列定量转基因模板DNA（0%、0.1%、0.5%、1%、2%、5%GMO含量）的PCR反应绘制标准曲线，待测样品即可通过比对获得初始模板量，从而实现实时定量分析。

（一）实验材料

转基因抗草甘膦大豆粉。

（二）实验原理

PCR检测技术的基本原理是根据食品中待检的外源基因核酸序列设计合适引物，经PCR反应使待检靶标DNA序列得以扩增放大，最后经凝胶电泳分析靶标PCR产物的有无，从而对食品中是否含有靶标转基因序列成分进行判定。由于目前商品化的绝大多数转基因食品普遍含有CaMV 35 S启动子，而CaMV 35 S启动子的DNA序列早已公开。所以在对食品样品的转基因背景一无所知的情况下，根据CaMV 35 S启动子的DNA序列设计合适引物，通过PCR反应检测食品中是否含有CaMV 35 S启动子基因序列，来判定该食品是否为转基因食品。

（三）实验试剂和设备

1.试剂

CTAB提取缓冲液（pH8.0）：称取4.00g CTAB，16.38g氯化钠，2.42g Tris，1.50g EDTA二钠，4.00g PVP－40，用适量水溶解后，调节pH，定容至200mL，高压灭菌。临用前按使用量加入β－巯基乙醇，使终浓度为2%；氯仿，异戊醇；70%乙醇；PCR反应试剂；核酸电泳相关试剂等。(www.xing528.com)

CaMV 35 S启动子正向引物：5′－GCT CCT ACA AAT GCC ATC A－3′

CaMV 35 S启动子反向引物：5′－GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA－3′

2.仪器设备

电子天平；15000r/min以上的台式离心机；离心管；移液器；恒温水浴锅；PCR仪；核酸电泳仪和电泳槽系统；核酸紫外观测仪或核酸凝胶成像系统。

（四）实验方法和步骤

1.CTAB法提取DNA

称取100mg样品加入2mL Eppendorf离心管中，加入700μL CTAB缓冲液，涡旋振荡器混匀后于65℃温育30min，期间颠倒混匀离心管2～3次。

加入700μL的三氯甲烷－异戊醇，涡旋振荡混匀后放置10min，期间颠倒混匀离心管2～3次；12000×g离心5min。

转移上清液至1.5mL Eppendorf离心管中，加入0.6倍体积经4℃预冷的异丙醇，于－20℃下静置5min，12000×g离心5min，小心弃去上清液。

加入70%乙醇1000μL，倾斜离心管，轻轻转动数圈后，4℃下8000×g离心1min，小心弃去上清液；加20μL RNase A酶（10μg/mL），37℃温育30min。

加入600μL氯化钠溶液，65℃温浴10min。加入600μL三氯甲烷－Tris饱和酚，颠倒混匀后，12000×g离心5min，转移上层水相至1.5mL Eppendorf离心管中。

加入0.6倍体积经4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀后，于4℃下静置30min；4℃下12000×g离心10min，小心弃去上清液。

加入1000μL经4℃预冷的70%乙醇，倾斜离心管，轻轻转动数圈后，4℃下12000×g离心10min，小心弃去上清液；用经4℃预冷的70%乙醇按相同方法重复洗一次。室温下或核酸真空干燥系统中挥干液体。

加50μL TE缓冲液溶解DNA，4℃保存备用。

转移上清液时注意不要吸到沉淀、漂浮物和液面分界层。每个样品提取时应做2个提取重复。

2.基因组DNA的电泳分析

取上述提取的基因组DNA 5μL，加1μL上样缓冲液，用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳分析，以检查所提取的DNA是否完整。如果电泳后在凝胶图谱上只显示一条分子质量较大的DNA电泳条带，则说明提取DNA完整性好，可以满足实验要求；如果电泳后无明显的电泳条带，而只是在泳道呈现模糊拖尾状DNA区段，则说明DNA已遭到降解破坏，不能应用于检测分析。

3.PCR扩增反应

（1）PCR反应体系 PCR反应的总体积为25μL，可以在不改变试剂浓度的情况下，适当扩大反应体系（如表5-8所示）。

表5-8 PCR反应体系

注：如PCR缓冲液中已经含有氯化镁，则氯化镁在反应混合液的终浓度应调整为1.5mmol/L。

（2）PCR对照 PCR试剂对照（即不含DNA模板的PCR扩增反应液试剂）；阴性目标DNA对照：不含外源目标核酸序列片段的模板。可使用阴性标准物质，并与测试样品等同处理进行核酸提取及PCR扩增。

（3）PCR反应参数 使用不同的PCR仪，可对参数作适当地调整（如表5-9所示）。

表5-9 PCR反应参数

4.确证

通过限制性内切酶酶切反应鉴定PCR产物，用限制性内切酶Xmn Ⅰ酶切PCR产物产生115bp和80bp两个片段。

5.结果判断

如果具备下列条件，就能确定检测到目标序列：

PCR扩增产生195bp的DNA片段；

经过序列分析，未知样品PCR扩增条带的DNA序列与阳性对照DNA序列一致；

用限制性内切酶Xmn Ⅰ酶切PCR产物产生预计大小的片段；

经过实时荧光PCR方法确证。

（一）适用范围

食品、饲料、种子及其环境材料中转基因大豆GTS－40-3-2成分的实时荧光PCR定量检测。

（二）实验原理

采用实时荧光定量PCR技术和可特异性扩增转基因大豆GTS－40-3-2中结构基因或品系特异性基因以及大豆Lectin的引物和两端标记荧光的探针，分别扩增测试样品DNA，并实时监测PCR产物。与此同时，用相同的引物、探针和条件扩增已知浓度的阳性标准物质（或阳性标准分子），以获得稳定的标准曲线，根据外源基因（结构特异性基因或品系性特异基因）和内源基因的标准曲线可分别计算出样品中对应基因的绝对含量（拷贝数或浓度），并由绝对含量计算转基因大豆GTS－40-3-2在测试样品中的相对含量。如采用阳性标准分子时计算相对含量应使用转换系数。

（三）检测

1.结构特异性基因检测

检测转基因大豆GTS－40-3-2结构特异性基因（CTP与CP4 EPSPS边界序列）和大豆内源Lectin基因。

相对定量检测低限：0.1%。

（1）主要试剂

①引物和探针：以转基因大豆GTS－40-3-2结构特异性基因及大豆内源Lectin基因所用引物序列和探针序列如表5-10所示。

表5-10 检测转墓因大豆GTS-40-3-2 结构特异性墓因的引物序列和探针序列

注：FAM：6－carboxyfluorescein，TAMRA：6－carboxytetramethylrhodamine；结构特异性基因扩增片段长度为74bp，Lectin扩增片段长度为74bp。

②反应体系：实时荧光定量PCR反应体系如表5-11所示。

表5-11 实时荧光定量PCR反应体系

注：ROX=carboxy－X－rhodmine；^aTaqMan Universal Master Mix是由ABI公司提供的产品商品名，此处亦可使用其他具有相同效果的产品。

（2）反应参数 检测转基因大豆GTS－40-3-2中结构特异性基因的实时荧光定量PCR反应参数如表5-12所示。

表5-12 实时荧光定量PCR反应参数

（3）计算结果 根据转基因大豆GTS－40-3-2结构特异性基因的绝对含量，可按下式计算其在测试样品中的相对含量：

2.品系特异性基因检测

检测转基因大豆GTS－40-3-2品系特异性基因（大豆基因组DNA与GTS－40-3-2品系特异基因之间的边界序列）和大豆内源Lectin基因。

绝对定量检测低限：40～100个拷贝。

（1）主要试剂

①引物和探针：检测转基因大豆GTS－40-3-2品系特异性基因及大豆内源Lectin基因的引物序列和探针序列如表5-13所示。

表5-13 检测GTS-40-3-2 品系特异性墓因的引物序列和探针序列

注：FAM：6－carboxyfluorescein，TAMRA：6－carboxytetramethylrhodamine；品系特异性基因扩增片段长度为85bp，Lectin扩增片段长度为74bp。

②反应体系：实时荧光定量PCR反应体系如表5-14所示。

表5-14 实时荧光定量PCR反应体系

注：ROX=carboxy－X－rhodmine；^aTaqMan Universal Master Mix是由ABI公司提供的产品商品名，此处亦可使用其他具有相同效果的产品。

（2）反应参数 实时荧光定量PCR反应参数如表5-15所示。

表5-15 实时荧光定量PCR反应参数

（3）计算结果 根据转基因大豆GTS－40-3-2品系特异性基因的绝对含量，可按下式计算其在测试样品中的相对含量：

沙门菌是一类常见的革兰阴性杆菌，目前至少发现67种O抗原和2000个以上的血清型，其中部分能引起人类疾病。所致疾病分为三种类型：肠热型、肠炎型和败血症。沙门菌通过肠道感染，是食品卫生部门重点检验的菌种，每一个带菌者都是潜在的传染源，应及早发现患者，进行隔离治疗，对饮食加工和服务人员应做定期健康检查。

检验沙门菌最常见的方法就是培养法，耗时比较长，一般需要4～7d。快速检验法有运动性增菌法、免疫扩散等方法，但特异性均不高，且需要增菌。一般作为辅助性实验诊断法。PCR法是敏感、特异、快速的新方法，为实验室检测沙门菌提供了新的思路。

（一）实验材料

乳及乳制品。

（二）方法提要

乳及乳制品经增菌后，取增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，8000×g离心5min，尽量弃去上清液；提取DNA，取DNA模板进行荧光PCR扩增，观察荧光PCR仪的实时曲线，对乳及乳制品中的沙门菌进行快速检验。

（三）试剂和材料

试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格，所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。

1.检测用引物（对）序列

5′－GCGTTCTGAACCTTTGGTAATAA－3′

5′－CGTTCGGGCAATTCATTA－3′

引物（对）10μmol/L。

2.探针

5′－FAM－TGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTTCT－TAMRA－3′

10μmol/L。

3.其他试剂

TaqDNA聚合酶；dNTP：100mmol/L。

核酸裂解液：2% CTAB，100mmol/L Tris－盐酸（pH8.0），1.4mol/L氯化钠，20mmol/L EDTA（pH8.0）。

10×PCR缓冲液：100mmol/L Tris－盐酸（pH8.3），0.5mol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。

（四）仪器和设备

实时荧光PCR仪；离心机：最大离心力≥16000×g；微量移液器：10、100、200、1000μL；恒温培养箱：（36±1）℃；恒温水浴箱：（80±0.5）℃；冰箱：2～8℃，－20℃；高压灭菌器；核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计；pH计；天平：感量0.01g。

（五）检测步骤

1.取样和增菌

取样前消毒样品包装的开启处和取样工具，无菌称取样品25g加入装有225mL预热到45℃的灭菌水的三角瓶中，使样品充分混匀，（36±1）℃培养18～22h。分别移取培养18～22h的悬液各10mL加入90mL缓冲蛋白胨水中，（36±1）℃培养18～22h。

2.模板DNA准备

每瓶培养的缓冲蛋白胨水分别取1mL加到1.5mL离心管中。13000～16000×g离心2min，弃去上清液。加入600μL核酸裂解液，重新悬浮起来。100℃水浴5min后，冷却至室温。13000～16000×g离心3min，将上清液移至干净的1.5mL离心管中。加入0.8倍体积的异丙醇，放入冰箱静置1h或过夜。13000～16000×g离心2min，弃去上清液，吸干。70%乙醇轻柔倒置几次洗涤，13000～16000×g离心2min，小心弃去上清液。吸干，风干10～15min。100μL双蒸水4℃保存（如不能及时检验，置于－20℃保存）。

也可使用经过评估的等效的细菌核酸提取试剂盒。

3.DNA浓度和纯度的测定

取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的吸收值。DNA的浓度按照下式计算：

式中 ρ——DNA浓度，μg/mL；

A₂₆₀——260nm处的吸光值；

N——核酸稀释倍数

当浓度为10～100μg/mL，A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.7～1.9之间时，适宜于实时荧光PCR扩增。

4.实时荧光PCR检测

反应体系总体积为25μL，其中含：10×PCR缓冲液2.5μL，引物对（10μmol/L）各1μL，dNTP（10μmol/L）1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，探针1μL，水16μL，模板DNA 2μL（浓度约10～100μg/mL）。反应步骤：94℃预变性1min，94℃变性5s，60℃退火延伸20s，30个循环。

检验过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以沙门菌纯培养物提取的DNA为阳性对照，以大肠杆菌或其他非沙门菌属肠杆菌纯培养物提取的DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照。

样品设3个重复，对照设2个重复，以Ct平均值作为最终结果。

5.结果判断

（1）PCR体系有效性判定

①空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct＞25.0。

②阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct＞25.0。

③阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct＜25.0。

以上三条有一条不满足，实验视为无效。

（2）检测结果判定 在PCR体系有效的情况下，被检样品进行检测时：

如有荧光对数增长，且Ct≤25，则判定为被检样品筛选阳性。

如无荧光对数增长，且Ct=30，则判定为被检样品筛选阴性。

如25＜Ct＜30，则重复一次。如再次扩增后Ct仍为＜30，则判定沙门菌筛选阳性；如再次扩增后无荧光对数增长，且Ct=30，则判定沙门菌筛选阴性。