在食品加工与贮藏过程中，由于受贮藏不当、加工温度、燃料等因素的影响，导致食品中出现某些有毒和有害物质。如食品焙烧中产生的丙烯酰胺，食品发霉变质产生各种霉菌毒素，食物在烧烤、油炸和烟熏的过程中污染了3，4－苯并芘；包装材料中的印刷油墨造成食品的多氯联苯污染；肉制品加工中添加硝酸盐与亚硝酸盐导致N－亚硝胺化合物超标等。这些有毒、有害物质的出现，降低了食品的食用价值，造成了资源的浪费，也影响了食用者的身体健康，甚至可能危及食用者的生命安全，因此有必要开展食品中有毒有害物质的检验，以便找出危害的根源，采取有力的措施，尽量减少食品在加工与贮藏过程中的污染。
由于食品加工过程中产生的有毒有害物质含量甚微，为百万分之一至亿万分之一，因而大多采用荧光分光光度法、液相色谱法、气相色谱法和气－质谱联用或液－质谱联用等仪器分析法测定。
淀粉类食品在高温（＞120℃）烹调下容易产生丙烯酰胺，尤其在过度油炸和烧烤时产生量最多。已有的研究表明，过量或长期食用高含量丙烯酰胺的食品，有一定的安全隐患。目前虽尚未对食品中丙烯酰胺制定限量标准，但国家颁布了测定方法标准（GB 5009.204-2014），该标准规定有“稳定性同位素稀释的液相色谱－质谱/质谱法”和“稳定性同位素稀释的气相色谱－质谱法”。这两种方法定性、定量准确，但对仪器要求较高，并需要13C3－丙烯酰胺内标，不适合普通实验室推广应用，也不方便本科生实验教学。本试验介绍HPLC法检测丙烯酰胺。
（一）测定原理
食品中丙烯酰胺经水萃取、膜过滤和柱分离，在HPLC用外标法进行测定。该方法操作简单、快捷。
（二）试剂和仪器
1.试剂
标准储备液：精确称取丙烯酰胺标准品（精确至0.1mg），用甲醇定容配制成1000mg/L的标准储备溶液，存放于－20℃水箱中。丙烯酰胺的标准应用液浓度为10mg/L水溶液（临用新配）。
2.仪器与设备
高效液相色谱仪、C18固相萃取柱（20cm×4.6mm，5μm）、固相萃取装置、高速离心机、漩涡混合器、0.45μm PVDF滤膜、均质器。
（三）实验步骤
1.样品前处理
准确称取0.5～2g均质后的样品于30mL离心管中，加入10mL蒸馏水，均质30s。离心10min（12000r/min），收集一次上清液，在沉淀中再加入10mL蒸馏水，均质后再离心10min（12000r/min），收集2次上清液。沉淀中再加入10mL蒸馏水，均质后再离心10min（12000r/min），收集3次上清液。用带针头的注射器避开油层吸取收集上清液体中间清液5mL，过0.45μm PVDF滤膜过滤，取2mL滤液过固相萃取柱，弃去最初的0.5mL流出液，收集生成的流出液，用2mL水洗脱，收集洗脱液，供进样测定。
2.HPLC测定及计算
（1）HPLC测定条件 流动相：甲醇∶水=5∶95（体积比）；流速：1.0mL/min；进样量：20μL；柱温：40℃；UV检测器（检测波长：210nm）。
（2）制作标准曲线 将标准应用液分别配制为0.005、0.01、0.02、0.2、1.0μg/mL不同浓度的丙烯酰胺标准溶液进行分析，以质量浓度ng/mL为横坐标，峰面积或峰高为纵坐标绘制标准曲线。
（3）计算 根据样品及标准品的保留时间定性分析和峰面积或峰高定量，将样品色谱图中丙烯酰胺对应的峰面积或峰高带入标准曲线中，计算出结果。
（四）注意事项
（1）用带针头的注射器吸取离心上清液时应尽量避开油层。但如果是油炸食品，油层可能较厚，此时可事先用正己烷提取1次可以除掉大部分油脂，以防止油脂的干扰。
（2）滤膜过滤液过C18固相萃取柱时，C18柱最好用5mL水和5mL甲醇预先活化。另外，洗脱液要自然流出，不用加压。
中国及东南亚各国利用烟熏、烧烤和油炸的方法加工食品的历史悠久，如：熏鱼、火腿、烤鱼片、炸油条等，特别是近些年来，烧烤肉制品备受人们的青睐。然而在熏烤食物的过程中，由于燃料的不完全燃烧产生了多环芳烃，使食物受到污染，同样在油炸食品时，如果油温超过200℃，并且油脂经多次反复加热使用，可使油炸食品中3，4－苯并芘的含量大大超过5μg/k g的食品卫生标准。3，4－苯并芘属多环芳烃类有机物，是目前世界上公认的强致癌、致畸物质之一。因此有必要检测这类物质在食品中的含量。
3，4－苯并芘的测定方法有薄层层析法，荧光分光光度法和高效液相色谱法。现介绍荧光分光光度法。
（一）检测原理
样品溶液经提取和分离柱净化后，用薄层层析法将3，4－苯并芘从多环芳烃类化合物中分离出来，然后从薄板上刮下含有3，4－苯并芘的部分，经乙醇溶出后，制备成待测溶液。利用3，4－苯并芘在紫外光照射下发射的荧光具有特征性吸收峰的特点，用荧光分光光度计测定其含量。
（二）试剂与仪器
1.试剂
①二甲基亚砜（简称DMSO），使用时与水以9∶1制成DMSO水溶液。二甲基甲酰胺（简称DMF），使用时与水以9∶1制成DMF水溶液。石油醚（沸程30～60℃）。无水硫酸钠（经550℃高温处理4h）。硅胶G（10～40μm颗粒）。
②有机试剂：乙醇、甲醇、己烷、环己烷、异辛烷、二氯甲烷、氯仿和苯（需经重蒸馏）。
③氢氧化钾、氢氧化钠、氯化钠、磷酸和乙酸酐，均为分析纯试剂。
④2%咖啡因水溶液：称取1g咖啡因，溶于50mL 50～60℃的蒸馏水中。
⑤硅镁型吸附剂（60～100目）：用四倍水洗涤四次后，在玻璃砂板漏斗中滤干，再用甲醇洗净，甲醇的使用量与吸附剂相同。抽干后，在130℃下于烘箱中干燥5h，随即装瓶贮存于干燥器中。临用前，加入5%的水以降低其活性，混匀后密闭平衡4h，备用。
⑥甘油淀粉润滑剂：将甘油与可溶性淀粉以33∶9的质量比混合，微火加热搅拌至透明状，用作涂抹玻璃仪器活塞。
⑦苯并芘标准溶液：准确称取3，4－苯并芘纯品固体10.0mg，用异辛烷溶解后，转移到100mL的棕色容量瓶中，稀释至刻度。此溶液为每毫升相当于100μg苯并芘的标准溶液。吸取此液1mL，用异辛烷准确稀释到10mL，即为每毫升相当于10μg的苯并芘标准溶液。使用时吸取此标准溶液1.0mL，用异辛烷再准确稀释100倍，即为每毫升相当于0.1μg苯并芘的标准工作液。
2.仪器与设备
①荧光分光光度计，具有双扫描功能。紫外灯（波长365nm，125W）。K－D浓缩器或旋转蒸发器。低速离心机。
②层析柱：长约350mm，ϕ20mm，具有玻璃砂滤板和玻璃活塞。
③薄层层析用仪器：涂布器、玻璃板、层析缸、圆形标本缸、微量注射器、脂肪提取器、锥形瓶、10mL具塞离心试管和分液漏斗（500mL和1000mL容量）。
（三）检测步骤
1.样品的制备
（1）粮食及其制品（包括大米、玉米、小麦、高粱等）经粉碎机粉碎后过40目筛，筛后混匀备用。
（2）鱼、肉及其烟熏制品 取其可食部分，用绞肉机绞碎后备用。
（3）酒类 酒类样品混合均匀后取样。啤酒先倒入大烧杯中，加温除去二氧化碳后取样。
2.样品的提取
含脂肪的固体样品如鱼、肉、粮食等需先行皂化后提取。不含脂肪的样品，如酒类可不经皂化而直接进行液－液萃取，
（1）粮食及其制品 称取均匀样品80.0g，装入滤纸筒内适当填紧。然后装入脂肪提取器内，加入70mL石油醚润湿样品，连接冷凝器和脂肪瓶。脂肪瓶内预先装有氢氧化钾6g（高粱、玉米加入12g）、100mL乙醇和60mL石油醚，在70℃水浴上提取及皂化4～6h。然后将全部皂化提取液趁热滤入500mL分液漏斗中，加入100mL石油醚再次提取，弃去水层。合并两次石油醚提取液，用水洗涤，提取3次，每次150mL。水洗时切勿用力过猛，以防止乳化。经水洗过的石油醚提取液通过无水硫酸钠柱脱水后，收集于250mL磨口锥形瓶中，用于下一步的净化操作。
（2）鱼、肉类及其熏制品 称取搅碎均匀的可食部分样品50.0g，置于250mL脂肪瓶中，加入100mL乙醇、12～15g氢氧化钾（如为干熟制品，则先用30mL水调匀后，再加入乙醇和氢氧化钾）。然后在沸水浴中回流加热约3h，待肉样全部消化后，趁热通过铺有少量脱脂棉的漏斗滤入1000mL分液漏斗中。再依次用50mL乙醇和150mL石油醚分2次洗涤脂肪瓶，洗涤液并入分液漏斗中。然后按粮食及其制品的样品提取方法进行提取，得到提取液，用于净化操作。
（3）酒类 吸取100mL酒样（白酒可取50mL，另加50mL水），注入500mL分液漏斗中，加入2g氯化钠，溶解后用环己烷提取2次，每次用50mL。将环己烷提取液用K－D浓缩器减压浓缩至溶液为20mL。将此浓缩液用二甲基亚砜水溶液在500mL分液漏斗中提取3次，每次用50mL。将提取液合并于另一个分液漏斗中，加入150mL冰水合剂，再以环己烷提取两次，每次用200mL。合并环己烷提取液，进行减压浓缩至50mL以下时，再移入原分液漏斗中。以等量水洗涤三次，静置分层，弃去水层。环己烷提取液用于净化。
3.样品的净化
样品净化的目的是将苯并芘等多环芳烃类化合物和其他混杂物分离开来。一般根据样品性质选用液－液分配法或柱层析净化法，或者将两种方法结合起来进行净化。
柱层析净化，一般采用硅镁吸附剂或中性氧化铝硅胶吸附剂制备层析分离柱。硅镁吸附剂的层析分离柱的装填方法是将无水硫酸钠装填于层析柱的底部，高度大约为1cm，接着加入12g硅镁吸附剂，然后再加入10g无水硫酸钠。再将装有30g无水硫酸钠和脱脂棉的漏斗置于层析柱上端。装填试剂时，一定要边装边用橡皮锤轻敲管壁，操作完毕，先用30mL己烷润湿漏斗和层析柱。待多余的己烷流出后，将上述待净化的任一种样品提取液分别以2～3mL/min速度流经层析柱。待流完后，用少量己烷淋洗漏斗。当淋洗液从层析柱中全部流出后，3，4－苯并芘已经被吸附在柱层上，然后用250mL烧瓶做接收器，用30mL苯以2～3mL/min的速度流经漏斗和上端管壁，然后再用80mL苯以相同速度进行洗脱，直到没有溶液流出时，再用少量苯洗涤接收瓶，洗脱液和洗涤液全部并入K－D浓缩器中。然后在约70℃水浴中减压浓缩至0.2mL左右时，用环己烷定容至0.5mL，摇匀后即可用作薄层层析的样品液。
4.样品的分离
经过柱层析净化的提取液可直接用薄层层析进行半定量分析，也用于荧光光度法测定。具体分离方法如下：
（1）制板与活化 称取14g硅胶G与约38～40mL 2%咖啡因水溶液（50～60℃），在研钵中研成糊状，用涂布器涂成10cm×20cm、厚度为0.25mm的薄层硅胶板4块。在室温下晾15min，再在80～85℃烘箱内活化1h，取出后置于干燥器内保存备用。如果制好的薄板放置超过一周，则需重新活化。
（2）点样与展开 将10cm×20cm的薄板以横向按3cm和7cm的宽度分成左右两个区域。以距底边3cm的高度为基线，在左边区域内用10μL 3，4－苯并芘标准溶液点成圆点，供展开后定位用。在右边区域内，将经柱净化过的样品浓缩液0.5mL，用毛细管点成宽不超过5mm，长不超过40mm的细条。并用环己烷洗涤K－D浓缩瓶数次，洗涤液也全部点在细条上。点样时，应边点样品边吹风。然后将点好的薄板置于层析缸中，用异辛烷－氯仿溶液（1∶2）作为展开剂。单向避光展开2～3次，展开约18cm时取出。
（3）收集3，4－苯并芘 在暗室内紫外光灯下观察，用大头针划出与标准3，4－苯并芘Rf值具有相同部位的蓝紫色荧光带，此荧光带即为分离出的3，4－苯并芘。然后将此蓝紫色的荧光带连同硅胶在操作箱内用手术刀小心刮下，并仔细收集到10mL具塞刻度离心管中，随即用5mL 60℃的乙醇溶解。将乙醇溶液以3000r/min离心后，上清液即可作为荧光分光光度法的测定样液。
5.样品的测定
（1）定性分析 将上述样品制备中薄层分离制得的样品待测溶液与3，4－苯并芘标准溶液进行激发光谱与发射光谱特征谱图的比较，从而确定样品中是否含有苯并芘。即将盛有样液的石英皿置于荧光分光光度计中，选择适当的负高压和狭缝，将激发波长固定在383nm处，对样液和标准液在发射波长380～500nm之间分别进行扫描。当测得的样品液与标准溶液的发射光谱相互吻合或相接近时，再将发射波长固定在405nm处，对样液和标准溶液在激发波长200～400nm之间分别进行扫描。如果测得两者的激发光谱也相吻合时，便可认为样品中含有3，4－苯并芘。
（2）3，4－苯并芘标准曲线的绘制 准确吸取每毫升含有0.1μg的3，4－苯并芘标准溶液20、40、60、80和100μL，分别注入10mL刻度试管中，然后添加乙醇至5mL。将此3，4－苯并芘标准系列溶液在激发波长383nm、激发光狭缝为5mm和发射波长405nm、发射光狭缝为3mm的条件下，从低浓度开始，依次在发射波长400、405、410nm处进行发射扫描，并按基线法用下式求出相对荧光强度I值。
根据上述测定结果，以相对荧光强度I为纵坐标，以其相应的标准3，4－苯并芘的浓度为横坐标绘制标准曲线。
（3）样品测定 将装样液的石英比色皿置于比色槽中，按上述标准曲线法测定样液的相对荧光强度，由标准曲线上查出对应的标准苯并芘的量（ng/mL），从而计算出样品中3，4－苯并芘的含量。
（4）计算
式中 m′——从标准曲线上查出3，4－苯并芘的含量，ng；
V——样品浓缩后的体积，mL；
m——样品质量，g；
V1——样品点样时吸取溶液的体积，mL。
（四）注意事项
（1）每批样品测定时，应做试剂空白，并对所测样品的相对荧光强度值加以校正。
（2）本法最低检出量为0.005μg。
多氯联苯（polychlorinated biphenyls，PCBs）类化合物作为工业化学品曾是广泛使用的介电物质和印刷油墨的组成成分。多氯联苯虽用途广泛，但难于生物降解，且容易富集，包装材料中的印刷油墨会造成食品的多氯联苯污染，含有多氯联苯的材料燃烧时会产生剧毒物质二
英，多氯联苯对水生生物和人类有很大危害，有致畸、致癌和致突变作用。因此有必要检测食品中多氯联苯的含量。
食品中PCBs残留量的检测技术因其含量少、种类多，最常用稳定性同位素稀释的气相色谱－质谱法，这也是GB 5009.190-2014规定的优选方法，该方法可对PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB138、PCB153、PCB180、PCB18、PCB33、PCB44、PCB70、PCB105、PCB128、PCB170、PCB187、PCB194、PCB195、PCB199和PCB206进行测定。其次是气相色谱法，这是GB 5009.190-2014规定的第二种方法，该方法是对PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB138、PCB153和PCB180测定的规定方法，本试验介绍该方法。
（一）检测原理
在试样中加入PCB198（定量内标），水浴加热振荡过程中用有机试剂萃取，后用酸及氧化铝柱分别净化，采用气相色谱－电子捕获检测器法测定，以保留时间定性，内标法定量。
（二）试剂和仪器
1.试剂
无水硫酸钠柱：将市售无水硫酸钠装入玻璃色谱柱，依次用正己烷和二氯甲烷淋洗两次，每次使用的溶剂体积约为无水硫酸钠体积的两倍。淋洗后，将无水硫酸钠转移至烧瓶中，在50℃下烘烤至干，并在225℃烘烤过夜，冷却后干燥器中保存。
色谱层析用碱性氧化铝：将市售色谱填料在660℃中烘烤6h，冷却后于干燥器中保存。
标准溶液：指示性多氯联苯的系列标准溶液，见表4-9。
表4-9 指示性多氯联苯的系列标准溶液
2.仪器与设备
气相色谱仪：配电子捕获检测器（ECD）；色谱柱：DB－5ms柱，30m×0.25mm×0.25μm，或等效色柱；组织匀浆器、绞肉机、旋转蒸发仪、氮气浓缩器、超声波清洗器、涡旋振荡器、水浴振荡器、离心机、层析柱。
（三）测定步骤
1.试样提取
（1）固体试样 称取试样5～10g（精确到0.1g），置具塞锥形瓶中，加入定量内标PCB198后，以适量正己烷+二氯甲烷（50+50）为提取溶液，于水浴振荡器上提取2h，水浴温度为40℃，振荡速度为200r/min。
（2）液体试样（不包括油脂类样品）称取试样10g（精确到0.1g），置具塞离心管中，加入定量内标PCB198和草酸钠0.5g，加甲醇10mL摇匀，加20mL乙醚+正己烷（25+75）振荡提取20min，以3000r/min离心5min，取上清液过装有5g无水硫酸钠的玻璃柱；残渣加20mL乙醚+正己烷（25+75）重复以上过程，合并提取液。
（3）浓缩 将提取液转移到茄形瓶中，旋转蒸发浓缩至近干。如分析结果以脂肪计，则需要测定试样脂肪含量。
（4）试样脂肪的测定 浓缩前准确称取空茄形瓶重量，将溶剂浓缩至干后，再次准确称取茄形瓶及残渣重量，两次称重结果的差值即为试样的脂肪含量。
2.试样净化
（1）硫酸净化 将浓缩的提取液转移至10mL试管中，用约5mL正己烷洗涤茄形瓶3～4次，洗液并入浓缩液中，用正己烷定容至刻度，并加入0.5mL浓硫酸，振摇1min，以3000r/min的转速离心5min，使硫酸层和有机层分离。如果上层溶液仍然有颜色，表明脂肪未完全除去，再加入一定量的浓硫酸，重复操作，直至上层溶液呈无色。
（2）碱性氧化铝柱净化柱装填 玻璃柱底端加入少量玻璃棉后，从底部开始，依此装入2.5g经过烘烤的碱性氧化铝、2g无水硫酸钠，用15mL正己烷预淋洗。
（3）净化 将试样提取（3）中的浓缩液转移至层析柱上，用约5mL正己烷洗涤茄形瓶3～4次，洗液一并转至层析柱中。当液面降至无水硫酸钠层时，加入30mL正己烷（2×15mL）洗脱；当液面降至无水硫酸钠层时，用25mL二氯甲烷+正己烷（5+95）洗脱。洗脱液旋转蒸发浓缩至近干。
3.试样溶液浓缩
将柱净化的试样溶液转移至进样瓶中，用少量正己烷洗茄形瓶3～4次，洗液并入进样瓶中，在氮气流下浓缩至1mL，待GC分析。
4.测定
（1）色谱条件色谱柱 DB－5ms柱，30m×0.25mm×0.25μm，或等效色谱柱；进样口温度：290℃；升温程序：开始温度90℃，保持0.5min，以15℃/min升温至200℃，保持5min，以2.5℃/min升温至250℃，保持2min，以20℃/min升温至265℃，保持5min；载气：高纯氮气（纯＞99.999%）；柱前压67kPa（相当于10psi）；进样量：不分流进样1μL。(www.xing528.com)
以保留时间定性，以试样和标准的峰高或峰面积比较定量。
（2）PCBs的定性分析以保留时间或相对保留时间进行定性分析，所检测的PCBs色谱峰信噪比（S/N）大于3。
（3）PCBs的定量测定
①相对响应因子（RRF）：采用内标法，以相对响应因子（RRF）进行定量计算。以校正标准溶液进样，按下式计算RRF值：
式中 RRF——目标化合物对定量内标的相对响应因子；
An——目标化合物的峰面积；
ρs——定量内标的浓度，μg/L；
As——定量内标的峰面积；
ρn——目标化合物的浓度，μg/L。
在系列标准溶液中，各目标化合物的RRF值相对标准偏差（RSD）应小于20%。
②含量计算
式中 Xn——目标化合物PCBs的含量，μg/kg；
An——目标化合物的峰面积；
ms——试样中加入定量内标的量，ng；
As——定量内标的峰面积；
RRF——目标化合物对定量内标的相对响应因子；
m——取样质量，g。
③检测限：本方法的检测限规定为具有3倍信噪比、相对保留时间符合要求的响应所对应的试样浓度。计算公式见下式：
式中 DL——检测限，μg/kg；
N——噪声峰高；
ms——加入定量内标的量，ng；
H——定量内标的峰高；
RRF——目标化合物对定量内标的相对响应因子；
m——试样质量，g。
试样基质、取样量、进样量、色谱分离状况、电噪声水平以及仪器灵敏度均可能对试样检测限造成影响，因此噪声水平应从实际试样谱图中获取。当某目标化合物的结果报告未检出时应同时报告试样检测限。
亚硝胺类化合物包括亚硝胺与亚硝酰胺两类，是亚硝酸盐与胺类合成的一类化学物质，分子中均含有N－亚硝基基团。自然界存在的亚硝胺类化合物不多，但其前体物质亚硝酸盐和胺类化合物却普遍存在。当亚硝酸盐与胺类相遇时，在一定条件下，可在腌腊制品、发酵食品和人体内合成一定量的亚硝基化合物，直接或间接地导致人体多种组织器官功能障碍或器质性病变。亚硝胺类化合物还具有强烈的致癌性，是目前世界公认的几大致癌物之一。
亚硝胺类的检测方法有比色法、气相色谱－热能分析仪法（适合啤酒中挥发性N－亚硝胺类的测定）、薄层层析法和气－质谱联用法（适合酒类、肉及肉制品、蔬菜、豆制品、茶叶等食品中N－亚硝基二甲胺、N－亚硝基二乙胺、N－亚硝基二丙胺及N－亚硝基吡咯烷含量的测定方法），这也是目前现行的国家推荐检测标准。本试验介绍不需要大型仪器的经典的薄层层析法。了解用薄层层析法测定N－亚硝胺类化合物的方法，并掌握薄层板的制备技术以及常用的吸附剂与展开剂的选用和配合规则。
（一）实验原理
经提取纯化所得的N－亚硝胺类化合物，在薄层板上展开后，利用其光解生成亚硝酸和仲胺的特性，分别用二氯化钯二苯胺试剂、Griess试剂（对亚硝酸）和茚三酮试剂（对仲胺）进行显色。为避免假阳性，应对以上三种试剂的显色进行综合判定。
（二）试剂及仪器
1.试剂
（1）无水碳酸钾、无水硫酸钠、氯化钠、正己烷、二氯甲烷、无水乙醚、乙醇、吡啶、冰醋酸。
（2）无水、无过氧化物的乙醚 乙醚中往往含有过氧化物而影响亚硝胺的测定，因此，必须除去乙醚中的过氧化物。将500mL乙醚置于分液漏斗中，加入10mL硫酸亚铁溶液（每110mL水中加6mL浓硫酸和6g硫酸亚铁），不断摇动，20min后弃去硫酸亚铁溶液再加入10mL硫酸亚铁溶液重复处理一次，然后再用水洗两次。取出处理过的乙醚5mL置于试管中，加入经稀盐酸酸化的碘化钾溶液2mL，振摇，于30min后碘化钾溶液不变黄，则乙醚处理为合格。
（3）阳离子交换树脂 强酸性，交联聚苯乙烯；硅胶G（层析用）。
（4）磷酸缓冲液 混合5mL磷酸二氢钾（1mol/L）和20mL磷酸氢二钠（0.5mol/L），用水稀释至250mL，pH为7～7.5。
（5）显色剂配制
①二氯化钯二苯胺试剂：1.5%二苯胺乙醇溶液和0.1%二氯化钯的0.2%氯化钠溶液，分别保存于4℃下，使用前以4∶1混合。
②格林（Griess）试剂：1%对氨基苯磺酸的30%乙酸溶液和0.1%α－萘胺的30%乙酸溶液分别保存于4℃下，使用前以1∶1混合。
③茚三酮试剂：0.3%茚三酮和2%吡啶的乙醇溶液。
④30%乙酸溶液：用冰醋酸加一定体积的水稀释而成。
（6）亚硝胺标准溶液配制 如常法制备的二甲基亚硝胺、二乙基亚硝胺、甲基苯基亚硝胺、甲基苄基亚硝胺，再重蒸馏或减压蒸馏1～2次以制得纯品。精确称取各类亚硝胺纯品，用无水、无过氧化物的乙醚作溶剂，配制成10μg/μL的乙醚溶液，再稀释成1μg/μL和0.1μg/μL的乙醚溶液，用黑纸或黑布包裹后置于冰箱中保存。
2.仪器与设备
具塞三角瓶；分液漏斗；微量注射器；紫外灯：40W，波长253nm；索氏抽提器：250、500mL；高速组织捣碎机；电热恒温水浴锅或大型恒温水浴槽；薄层层析用仪器；滤纸：经索氏抽提器用无水无过氧化物乙醚提取4h，以除去干扰物质，吹干备用。
（三）测定步骤
1.样品提取
（1）粉末类粮食（面粉、玉米粉、糠等，土壤也可参照此法提取）取样100g，用处理过的滤纸包好后放入500mL索氏抽提器内，加入已除去过氧化物的乙醚500mL，在40～45℃恒温水浴上回流提取10h，将乙醚提取液移入圆底烧瓶中，并加入水100mL（先在热水浴上蒸馏出大部分乙醚，然后与发生水蒸气的玻璃烧瓶连接），进行水蒸气蒸馏，收集蒸馏液大约200mL。加入20g碳酸钾，搅拌，溶解，并转入分液漏斗内。分出乙醚层，置于1L带塞三角瓶内。水层用除去过氧化物的乙醚提取三次，每次用60mL，每次强烈振摇8～10min，收集乙醚于上述1L带塞三角瓶内，并加入20g无水硫酸钠。不断振摇30～45min后，用处理过的滤纸过滤。用无水乙醚20mL洗涤滤纸上的硫酸钠，合并乙醚液，于40～45℃恒温水浴上浓缩至体积为0.5mL。上述操作要尽量避光，浓缩液放入小试管中置于冰箱内备用。
（2）蔬菜类食品（腌菜、泡菜、菠菜等）取样100g，切碎，于组织捣碎机中加入二氯甲烷200～300mL和碳酸钾5g，捣碎5min，过滤于长颈圆底烧瓶中，再以二氯甲烷50mL洗涤残渣，洗液合并于滤液中，再加入25mL磷酸缓冲液和100～150mL水，在60℃水浴中除去二氯甲烷后再加热10～15min（二氯甲烷可回收）。然后用水蒸气蒸馏，收集溜出液200mL，蒸馏瓶需用黑布包好。在馏出液中加入20g碳酸钾，在500mL分液漏斗中，以每次100mL二氯甲烷，分三次提取，然后用无水硫酸钠吸去二氯甲烷中的水，过滤，并用二氯甲烷洗涤硫酸钠，洗液合并于滤液中，浓缩至20mL，取一定量置于具塞试管再浓缩至0.5mL备用。上述操作要尽量避光，浓缩后的试管用黑布或黑纸遮盖，置于冰箱内。
（3）腌制肉类、鱼类、干酪等 取样100g，切成小块，移入组织捣碎机中，加二氯甲烷400mL和碳酸钾5g，捣碎5min，过滤于长颈圆底烧瓶中，再以二氯甲烷50mL洗涤残渣，洗液合并于滤液中。加入磷酸缓冲液25mL和水约200mL于滤液中，在60℃水浴中除去二氯甲烷后再加热10～15min（二氯甲烷可回收）。然后用水蒸气蒸馏，收集馏出液200mL，蒸馏瓶需用黑布包好。馏出液中加入5%醋酸钠溶液（缓冲液）1mL，使pH为4.5，然后通过阳离子交换树脂（2.5cm×2.5cm），用水约10mL洗柱，合并流出物，加碳酸钾20g碱化，以下用二氯甲烷提取，操作与上述（2）相同。
2.薄层层析
（1）制板活化 取硅胶G加倍量或稍多的一些水，调制至黏度适宜后涂板，于105℃活化1.5h。
（2）点样 用微量注射器将亚硝胺标准溶液0.5μg和1.0μg点于薄板两侧，再用微量注射器或毛细玻璃管将样品溶液0.1mL点于薄板中间一点上，共点三块板。
（3）展开 第一次用正己烷展开至10cm，取出吹干。第二次用正己烷－乙醚－二氯甲烷溶液（4∶3∶2）展开至10mL，取出吹干。层析缸用黑布或黑纸遮盖。
（4）显色和判断
①薄层板喷二氯化钯二苯胺试剂，在湿润状态下放在没有滤光片的紫外灯下照射3～5min，亚硝胺化合物呈蓝或蓝紫色斑点。
②薄层板在没有滤光片的紫外灯下照射5～10min后，喷Griess试剂，亚硝胺化合物呈玫瑰红斑点。
③薄层板先小心地均匀喷以30%乙酸，然后在没有滤光片的紫外灯下照射5～10min，用热吹风机吹5～10min，使乙酸挥发掉，再喷茚三酮试剂，并将板放在80℃烤箱内烤10～15min，亚硝胺化合物呈橘红色斑点。如果三种试剂均为阳性，则可以认为食物中存在亚硝胺；若样品中出现与标准品Rf值相同的斑点，可以初步认为样品中存在的亚硝胺与已知亚硝胺相同。样品中亚硝胺的量需要做样品的限量实验，并与标准亚硝胺的灵敏度实验相比较，以计算出样品中亚硝胺的大概含量。
（四）注意事项
1.几种亚硝胺在不同溶剂中的Rf值如表4-10所示。
表4-10 几种亚硝胺在不同溶剂中的Rf值
2.不同溶剂系统分离亚硝胺的种类如表4-11所示。
表4-11 不同溶剂系统分离亚硝胺的种类
多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAH）是一类广泛存在于环境中的有机化合物，有致癌作用的多环芳烃约有20种，其中最具有代表性的致癌物为3，4－苯并芘（五环化合物），其次为1，2－苯并芘（四环化合物）和3，4，9，10－苯并芘（六环化合物）。多环芳烃产生的原因很多，当煤炭、石油和天然气等燃烧不完全时，便形成多环芳烃化合物。细菌、原生动物、淡水藻类和高等植物本身也能合成多环芳烃。
多环芳烃的测定方法有薄层层析法、高效液相色谱法、气相色谱－质谱法（GB/T 23213-2008）。本试验介绍用甲醇－水作流动相，采用梯度洗脱和程序切换荧光检测波长的高效液相色谱法。
（一）测定原理
多环芳烃类化合物分子中具有刚性的平面结构和多个共轭双键，受紫外光照射会发出荧光，荧光的强度与样液中多环芳烃的浓度成正比。利用甲醇－水作流动相进行反向高效液相色谱梯度洗脱，采用程序切换波长的荧光检测器检测分离开的多环芳烃，达到快速、准确测定食品中多环芳烃的目的。
（二）试剂和仪器
1.试剂
（1）PAH标准储备液 准确称取一定量PAH，用环己烷或苯溶解定容。其各自的浓度为：萘（Na）1400μg/mL，菲（Phe）1560μg/mL，蒽（Ant）1080μg/mL，荧蒽（Flt）318μg/mL，芘（Py）1140μg/mL，屈（Chy）1080μg/mL，苯并（a）蒽（BaA）1260μg/mL，苯并［b］荧蒽（BbF）176μg/mL，苯并（k）荧蒽（BkF）1160μg/mL，苯并［a］芘（BaP）1400μg/mL，二苯并［a，h］蒽（dBahA）1200μg/mL，苯并［g，h，I］苝（BghiP）190μg/mL，茚并［1，2，3－cd］芘（IndenoP）280μg/mL。
（2）PAH标准应用液 根据待测样品中多环芳烃的含量，将PAH标准储备液用甲醇稀释100～1000倍，配成浓度为0.1～10μg/mL PAH的混合标液。
（3）甲醇 为分析纯，重蒸后经0.3μm滤膜抽滤。
2.仪器与设备
（1）高效液相色谱仪 配有荧光检测器色谱柱，Phenomenex（USA）；C18柱（ODS），5μm，250mm×4.6mm，i. d；液相色谱微量进样器（25μL，100μL）。
（2）玻璃色谱柱（Sephadex LH－20目），20mm×250mm；K－D浓缩仪；玻璃砂芯漏斗：40～60目。
（三）测定步骤
1.样品制备与处理
（1）样品处理 取熏烤肉样用热水洗去表面黏附的杂质，晾干后去骨头，将可食部分粉碎后备用。
（2）样品的提取、净化与富集
①提取：准确称取样品100g于500mL圆底烧瓶中，加入2mol/L氢氧化钾的甲醇－水（9+1）溶液200mL，在沸水浴中回流加热3h。
②净化：将皂化液移入500mL分液漏斗中，用100mL环己烷分两次洗涤回流瓶，洗液并入分液漏斗中，振摇1min，静置分层，下层水溶液放至另一500mL分液漏斗中。用100mL环己烷重复提取2次，合并环己烷。先用200mL甲醇+水（1+1）提取1min，弃去甲醇－水层，再用200mL水提2次，弃去水层。在旋转蒸发仪上浓缩环己烷液至40mL，移入125mL分液漏斗中，以少量环己烷洗蒸发瓶2次，合并环己烷。用硫酸（6+4）50mL净化提取2次，每次摇1min，弃去硫酸液，用水洗环己烷层至中性。将环己烷层通过装有6g硅胶和少量无水硫酸钠的40～60目玻璃砂芯漏斗过滤，另用50mL环己烷洗涤漏斗，合并环己烷，在旋转蒸发仪上浓缩环己烷至2mL。
③富集：将环己烷浓缩液转移至10g Sephadex LH－20柱内，用异丙醇洗脱，弃去前50mL，收集50～150mL馏分段洗脱液，在K－D浓缩仪（70℃）上蒸发至0.2mL左右时，用甲醇定容至1.0mL。置冰箱中备用。
2.PAH标准曲线的绘制
分别吸取0.10，0.50，1.00，3.00和5.00μL PAH混合标准液进行色谱分析，以各PAH含量（ng）为横坐标，相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，共13条。
色谱分析条件：柱温25℃，流速1mL/min；梯度洗脱程序：由73%甲醇开始，42min线性升至92%甲酵；按表4-12进行程序波长切换。
表4-12 检测波长切换时间程序
3.样品测定
取待测样品液5～20μL按照测定PAH混合标准液的同样条件进行色谱分析，以保留时间定性，峰面积定量。根据样品峰面积，从各PAH标准曲线查得其含量mx。再计算各种PAH的含量。
计算公式如下：
式中 mx——由峰面积查得的相应PAH含量，μg；
V——样品浓缩体积mL；
m——样品质量，g；
V1——进样体积，mL。
（四）注意事项
（1）根据标准样品的出峰顺序调节波长切换的时间。
（2）用热水洗涤熏肉样品时，注意不要造成多环芳烃的损失。
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