黄曲霉毒素（Aflatoxin，简称AF）是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物。黄曲霉毒素是一组化学结构类似的化合物，目前已分离鉴定出20多种，主要是黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2以及由黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2在体内经过羟化而衍生成的代谢产物黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素M2等。黄曲霉毒素的基本结构为二呋喃香豆素衍生物，在紫外光下，黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2发蓝紫色荧光，黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2发黄绿色荧光。黄曲霉毒素耐热，可溶于氯仿、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水、石油醚、己烷和乙醚。一般在中性及酸性溶液中较稳定，在pH9～10的强碱性溶液中迅速分解。黄曲霉毒素B1的分解温度为268℃，紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性。
由于黄曲霉毒素是一类毒性极强的剧毒物质，1993年被世界卫生组织的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，表现为肝细胞变性、坏死，最终导致器官严重损伤。
黄曲霉的最适产毒温度为25～32℃。我国产生黄曲霉毒素的产毒菌株主要分布在华中、华南和华东地区，产毒量也较高，常常存在于动植物性食品，各种坚果，粮油及其制品，如花生、胡桃、杏仁、大豆、稻谷、玉米、调味品、乳制品、食用油等制品中也经常发现黄曲霉毒素。我国规定了食品中黄曲霉毒素的允许限量花生、玉米为20μg/kg，乳及乳制品为0.5μg/kg，豆类、发酵食品为5μg/kg。
黄曲霉毒素的检测方法包括：薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、微柱筛选法、酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫亲和柱－荧光分光光度法、免疫亲和柱－HPLC法等。本实验主要介绍免疫亲和柱－荧光分光光度法和免疫亲和柱净化－高效液相色谱法。
（一）免疫亲和柱－荧光分光光度法
1.检测原理
样品中的黄曲霉毒素用一定比例的甲醇－水提取，提取液经过过滤、稀释后，用免疫亲和柱分离净化，以甲醇将亲和柱上的黄曲霉毒素淋洗下来，在淋洗液中加入溴溶液衍生，以提高测定灵敏度，然后用荧光分光光度计进行定量测定。
2.主要试剂及仪器
真菌毒素专用荧光分析仪；黄曲霉毒素免疫亲和柱；0.03%的溴溶液；荧光分析仪校准溶液：3.4g二水硫酸奎宁，用0.05mol/L稀硫酸稀释至100mL。
氯化钠、甲醇（色谱级）、重蒸馏水、1.5μm的玻璃纤维滤纸。
3.检测步骤
（1）标定荧光计 配制0.003%溴衍生溶液（每天配制）：取5mL 0.03%的溴溶液，加入45mL的蒸馏水；甲醇∶水（60∶40，体积比）溶液；试剂对照试验（1mL甲醇+1mL 0.003%溴衍生液置于测试管中），荧光计读数应为0；纯水对照实验（2mL纯水置于测试管中），荧光计读数应为0。
（2）毒素提取 称取25g样品，5g氯化钠，置于搅拌杯中，加入125mL甲醇∶水（60∶40）溶液，盖上杯盖高速搅拌1min后将提取物倒入折叠式滤纸上，滤液收集于干净的容器中。吸取20mL滤液，置于干净的容器中，用20mL蒸馏水稀释，混匀。经过玻璃纤维滤纸过滤，滤液收集于玻璃注射管中。
（3）亲和柱操作 取10mL滤液以1～2滴/s的流速全部通过Af－LaTest－P亲和柱，直至空气进入亲和柱，取10mL蒸馏水以2滴/s的流速通过亲和柱；取10mL蒸馏水以2滴/s的流速再次通过亲和柱，直至空气进入到亲和柱中。用1.0mL色谱级的甲醇以1～2滴/s的流速淋洗亲和柱，将所有样品淋洗液（1mL）收集于玻璃测试管中。取1.0mL 0.003%溴衍生溶液加到测试管的淋洗液中，混匀。
（4）荧光光度计测定 将制备好样液的测试管置于已标定好的荧光计中。60s后读数，测定结果为黄曲霉毒素B1+黄曲霉毒素B2+黄曲霉毒素G1+黄曲霉毒素G2的总量。
4.注意事项
（1）溴衍生溶液需当天配制，当天使用，不可重复使用。
（2）严格操作样品处理过程。
（3）操作人员需戴口罩和手套进行样品处理，避免有毒有机溶剂毒害。
（4）一般来说，每个检测项目均应做平行试验和空白试验。平行试验是采用相同的分析步骤，空白试验是除不加试样外，其他步骤同测定平行试验。
（二）免疫亲和柱净化－高效液相色谱法
1.检测原理
样品经过甲醇－水提取后，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析柱层析净化，经高效液相色谱仪分离，荧光检测器柱后光化学衍生增强后，综合测定黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2等含量。
2.主要试剂及仪器
（1）试剂
①甲醇、苯及乙腈为色谱纯，其试剂为分析纯。甲醇+水（8+2）：取80mL甲酵加20mL水，混合均匀。甲醇+水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水，混合均匀。苯+乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯，混合均匀。
②黄曲霉毒素标准储备溶液：用苯+乙腈（98+2）溶液分别配制0.100mg/mL黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标准储备液，保存于4℃备用，可使用1年。
③黄曲霉毒素混合标准溶液：准确移取适量的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标准储备溶，50℃下，氮气吹干仪吹干，用适量的甲醇+水（45+55）溶液定容为混合标准工作液，黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2各分别为0、1、5、10、50ng/mL。
④PBS缓冲溶液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH至7.0，最后用纯水稀释至1000mL。
（2）仪器与设备 高速均质器（18000～22000r/min）或振荡器，黄曲霉毒素免疫亲和柱（柱容量≥300ng），玻璃纤维滤纸（直径11cm，孔径1.5μm），氮吹仪，光化学衍生系统，高效液相色谱仪（带荧光检测器）。
3.检测步骤
（1）提取 取样品（粒度小于1mm）50.0g于250mL具塞锥形瓶中，加入5.0g氯化钠及准确加入100.0mL甲醇+水（8+2）溶液，以均质器高速搅拌提取2min，或振荡器振荡30min。定量滤纸过滤，移取10.0mL滤液并加入40.0mL PBS缓冲溶液稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1～2次，至滤液澄清，备用。
（2）净化 将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃定量管下。准确移取10.0mL样品提取液注入玻璃定量管中，将空气压力泵与玻璃定量管连接，调节压力使溶液以不超过2mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，待溶液全部流出后，以10.0mL纯水清洗柱子2次，弃去全部流出液，准确加入1.0mL甲醇洗脱，流速不超过1.0mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，加纯水定容为2.0mL，供色谱检测用。
（3）测定
①色谱条件：色谱柱：C18柱（150mm×4.6mm id），流动相：甲醇+水（45+55）溶液，流速：0.8mL/min，检测波长：激发波长360nm、发射波长440nm。
②光化学衍系统：柱温：30℃，进样量：20μL。
③色谱测定：分别取相同体积样液和标准工作溶液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的响应值（峰高或峰而积）。经过与黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标准溶液谱图比较响应值，得到试样中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的浓度ρ（μg/L）。
（4）结果计算 样品中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2含量，按下式计算：
式中 Ai——样品溶液中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2各组分的峰面积值；
Vi——样品的总稀释体积，mL；
ρi——黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2各标准溶液浓度，ng/mL；
Vst——标准溶液的进样体积，μL；
Ast——黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2各标准溶液峰面积平均值；
m——试样质量，g。
4.注意事项
黄曲霉毒素是高致癌性物质，应十分小心操作，使用过的玻璃容器及黄曲霉毒素溶液用5%浓度次氯酸钠溶液浸泡过夜。沾有黄曲霉毒素的废弃物按有毒物处理。
赭曲霉毒素（Ochratoxins）是赭色曲霉属和青霉属产生的代谢产物，包括A，B，C，D等多种分子结构类似的化合物，其中以赭曲霉毒素A（OchratoxinA，简称OA）毒性最强，是自然界中主要天然污染物。玉米、谷物和大豆中均可分离到赭曲霉毒素。但饲料中的OA污染水平高于食品。由于OA能通过饲料进入动物组织，人类通过食用动物源食品而摄入OA。该毒素主要表现为肾脏毒性，可严重损害肾脏及肝脏，对实验动物具有致畸和致癌作用。
OA是无色结晶化合物，溶于极性溶剂和稀碳酸氢钠溶液，微溶于水。其乙醇溶液可置冰箱中保存一年以上，但在谷物中或接触紫外线，几天就会降解。
产生OA的霉菌，主要是青霉属和曲霉属，如赭曲霉（A.ochraceus）、淡褐色曲霉属（A.alutaceus）、硫色曲霉（A.Sulphureus）、菌核曲霉（A.sclerotium）、蜂蜜曲霉（A.melleus）、洋葱曲霉（A.alliaceus）、孔曲霉（A.ostianus）及圆弧青霉（P.cyclopium）、变幻青霉（P.variabile）等。曲霉属和青霉属产毒条件是：曲霉属的最适宜水分活度为0.99，产毒温度为12～37℃，青霉属的最适宜水分活度为0.95，产毒温度为4～31℃。容易感染赭曲霉毒素的商品包括大豆、绿豆、咖啡豆、玉米、小麦、大麦、燕麦、啤酒、葡萄汁、干果、调味品、草本植物等。
OA的检测方法包括：薄层色谱法、HPLC、酶联免疫吸附法、免疫亲和柱－荧光法、免疫亲和柱－HPLC法等。本实验主要介绍免疫亲和柱－HPLC法。该方法可适用于粮食和粮食制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品中OA含量的测定。
（一）检测原理
用提取液粗提样品中的OA，然后经免疫亲和柱收集浓缩、甲醇洗脱液洗脱并定容后，用荧光检测器的高效液相色谱测定，外标法定量。
（二）试剂及仪器
1.试剂
①甲醇、乙腈及冰乙酸等为色谱纯，其他所用试剂均为分析纯。
②提取液1：甲醇+水（80+20）。提取液2：称取150g氯化钠、20g碳酸氢钠溶于约950mL水中，加水定容至1L。冲洗液：称取25g氯化钠、5g碳酸氢钠溶于约950mL水中，加水定容至1L。真菌毒素清洗缓冲液：称取25.0g氯化钠、5.0g碳酸氢钠溶于水中，加入0.1mL吐温－20，用水稀释至1L。OA标准品：纯度＞98%。
③OA标准储备液：准确称取一定量的OA标准品，用甲醇+乙腈（1+1）溶解，配成0.1mg/mL的标准储备液，在－20℃保存，可使用3个月。
④OA标准工作液：根据使用需要，准确吸取一定量的OA储备液，用流动相稀释，分别配成相当于1、5、10、20、50ng/mL的标准工作液，4℃保存，可使用7d。
2.仪器与设备
OA免疫亲和柱，玻璃纤维滤纸（直径11cm、孔径1.5μm、无荧光特性），高效液相色谱仪（配有荧光检测器），均质器（转速大于10000r/min），高速万能粉碎机（转速10000r/min）、空气压力泵、超声波发生器等。
（三）检测步骤
1.样品的制备与提取
（1）粮食和粮食制品 将样品研磨，硬质的粮食等用高速万能粉碎机磨细并通过试验筛（56mm），不要磨成粉末。取20.00g左右磨碎的试样于100mL容量瓶中，加入5.0g氯化钠，用提取液1定容至刻度，混匀，转移至均质杯中，高速搅拌提取2min。定量滤纸过滤，移取10.0mL滤液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液A于干净的容器中。
（2）酒类 取脱气酒类试样（含二氧化碳的酒类样品使用前先置于4℃冰箱冷藏30min，过滤或超声脱气）或其他不含二氧化碳的酒类试样20.00g左右，置于25mL容量瓶中，加提取液2定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液B于干净的容器中。
（3）酱油、醋、酱及酱制品 称取25.00g左右混匀的试样，用提取液1定容至50.0mL，超声提取5min。定量滤纸过滤，移取10.0mL滤液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液C于干净的容器中。
2.样品的净化
（1）粮食和粮食制品 将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取滤液A 10.0mL，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10mL真菌毒素清洗缓冲液、10mL水淋洗免疫亲和柱，流速约为1～2滴/s，弃去全部流出液，抽干小柱。
（2）酒类 将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取滤液B 10.0mL，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10mL冲洗液、10mL水淋洗免疫亲和柱，流速约为1～2滴/s，弃去全部流出液，抽干小柱。
（3）酱油、醋、酱及酱制品 将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取滤液C 10.0mL，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10mL真菌毒素清洗缓冲液、10mL水淋洗免疫亲和柱，流速约为1～2滴/s，弃去全部流出液，抽干小柱。
3.洗脱
准确加入1.0mL甲醇洗脱，流速约为1滴/s，收集全部洗脱液于干净的玻璃试管中，用甲醇定容至1.0mL，供HPLC测定。
4.高效液相色谱参考条件
①色谱柱：C18柱，5μm，150mm×4.6mm或相当者；柱温：35℃。
②流动相：乙腈+水+冰乙酸（99+99+2）；流速：0.9mL/min。
③进样量：10～100μL；检测波长：激发波长333nm，发射波长477nm。
5.定量测定
以OA标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对试样进行定量，标准工作溶液和试样溶液中OA的响应值均应在仪器检测线性范围内。
6.结果计算
试样中OA的含量按下式计算：
式中 X——试样中赭曲霉毒素A的含量，μg/kg；
ρ1——试样溶液中赭曲霉毒素A的浓度，ng/mL；
ρ0——空白试样溶液中赭曲霉毒素A的浓度，ng/mL；
V——甲醇洗脱液体积，mL；
m——试样的质量，g；
f——稀释倍数。
伏马毒素B（Fumonisin，FB）是1989年发现的一种新型毒素，是串珠镰刀菌在一定温度和湿度条件下繁殖所产生的一类霉菌毒素。目前已知有7种衍生物，有伏马毒素B1、伏马毒素B2、伏马毒素B3等，其中60%以上是伏马毒素B1，其毒性也最强。伏马毒素B1为白色针状结晶，易溶于水。研究证实，伏马毒素可导致马产生白脑软化症（ELEM），神经性中毒而呈现意识障碍、失明和运动失调，甚至造成死亡；并被怀疑可诱发人类的食道癌等疾病，从而对畜牧业及人类的健康构成威胁。
玉米最易感染串珠镰刀菌，尤其在贮藏过程中水分在18%～23%时，最适宜串珠镰刀菌的生长和繁殖，导致玉米伏马毒素含量的增加，并由此产生人畜安全隐患。另据资料表明，在大米、面条、调味品、高粱、啤酒中也有较低浓度的伏马毒素存在。美国规定伏马毒素的限量为2mg/kg。
伏马毒素残留主要有免疫亲和柱－荧光法、免疫亲和柱－HPLC法、毛细管电泳法、液相色谱/质谱法及伏马毒素试剂盒法等方法检测。2017年3月起实施的GB 5009.240-2016《食品安全国家标准食品中伏马毒素的测定检测标准》规定伏马毒素检测主要是为伏马毒素B1、伏马毒素B2和伏马毒素B3三种；同时介绍了免疫亲和柱净化－柱后衍生高效液相色谱法作为第一法，高效液相色谱－串联质谱联用法作为第二法，免疫亲和柱净化－柱前衍生高效液相色谱法为第三法。其中第三法特别适用于玉米及其制品中伏马毒素的测定。本试验主要介绍第一法，同时测定相关食品中伏马毒素B1、伏马毒素B2和伏马毒素B3残留量。
（一）检测原理
样品中的伏马毒素可用一定比例的乙腈－水溶液提取，经稀释后过免疫亲和柱净化，去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质，然后经高效液相色谱分离后，邻苯二甲醛柱后衍生，荧光检测，外标法定量。
（二）试剂及仪器
1.试剂
甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
2.溶液配制
（1）磷酸盐缓冲液（PBS）称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾，用980mL水溶解，用盐酸调整pH至7.4，用水稀释至1000mL，混合均匀。
（2）吐温－20/PBS溶液（0.1%）吸取1mL吐温－20，加入PBS稀释至1000mL，混合均匀。
（3）硼砂溶液（0.05mol/L，pH10.5）称取硼砂19.1g，溶于980mL水中，用氢氧化钠溶液调pH至10.5，用水稀释至1000mL，混合均匀。
（4）衍生溶液 称取2.0g邻苯二甲醛，溶于20mL甲醇中，用硼砂溶液（0.05mol/L，pH10.5）稀释至500mL，加入2－巯基乙醇500μL，混匀，装入棕色瓶中，现用现配。
3.标准品
（1）伏马毒素B1（FB1）、伏马毒素B2（FB2）和伏马毒素B3（FB3），纯度≥95%，或有证标准溶液。
（2）标准溶液配制
①标准储备溶液（0.1mg/mL）：分别准确称取FB1、FB2、FB3各0.01g（精确至0.0001g）至小烧杯中，用乙腈－水溶液（50+50）溶解，并转移至100mL容量瓶中，定容至刻度。此溶液密封后避光－20℃保存。有效期6个月。
②混合标准溶液：准确吸取FB1标准储备液1mL、FB2和FB3标准储备液各0.5mL至同一10mL容量瓶中，加乙腈－水溶液（50+50）稀释至刻度，得到FB1浓度为10μg/mL、FB2和FB3浓度为5μg/mL的混合标准溶液。再稀释10倍，得到FB1浓度为1μg/mL、FB2和FB3浓度为0.5μg/mL的混合标准溶液。此溶液密封后避光4℃保存，有效期6个月。
③混合标准工作溶液：准确吸取混合标准溶液，用乙腈－水溶液（50+50）稀释，配制成FB1浓度依次为20、80、160、240、320、400ng/mL，FB2和FB3浓度依次为10、40、80、120、160、200ng/mL的系列混合标准工作溶液。
4.仪器与设备
高效液相色谱仪，带荧光检测器；柱后衍生系统；离心机（转速≥4000r/min）；免疫亲和柱（柱容量≥5000ng，FB1柱回收率≥80%）。
（三）检测步骤
1.样品制备
将固体样品按四分法缩分至1kg，全部用谷物粉碎机磨碎并磨细至粒度小于1mm，混匀分成2份作为试样，分别装入洁净的容器内，密封，标识后置于4℃下避光保存。玉米油样品直接取2份作为试样，分别装入洁净的容器内，密封，标识后置于4℃下避光保存。
2.试样提取
准确称取固体样品5g（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入20mL乙腈－水溶液（50+50），涡旋或振荡提取20min，取出后，在4000r/min下离心5min，将上清液转移至另一离心管中。玉米油样品操作同固体样品，提取液在下层。
3.试样净化
取2mL提取液，加入47mL吐温－20/PBS溶液，混合均匀后过免疫亲和柱，流速控制在1～3mL/min，用10mLPBS缓冲液淋洗免疫亲和柱，分别用1mL甲醇－乙酸溶液（98+2）洗脱免疫亲和柱三次，收集洗脱液，55℃下氮吹至干，加入1mL乙腈－水溶液（20+80）溶解残渣。涡旋30s，过0.45μm微孔滤膜后，收集于进样瓶中，待测。
4.仪器参考条件
色谱柱：C18色谱柱：250mm×4.6mm，5μm，或相当者；检测波长：激发波长335nm；发射波长440nm；流动相：A：甲酸水溶液（0.1%），B：甲醇；梯度洗脱（洗脱程序见表4-7），流动相流速：0.8mL/min；衍生液流速：0.4mL/min；柱温：40℃，反应器温度：40℃；进样量：50μL。
表4-7 流动相洗脱程序
5.试样测定
分别取50.0μL系列伏马毒素混合标准工作溶液按浓度从低到高依次注入高效液相色谱仪；待仪器条件稳定后，以目标物质的浓度为横坐标（x轴），目标物质的峰面积为纵坐标（y轴），对各个数据点进行最小二乘线性拟合，标准工作曲线按式（4-12）计算：
式中 y——目标物质的峰面积比；
a——回归曲线的斜率；
x——目标物质的浓度；
b——回归曲线的截距。
6.空白试验
不称取样品，同样进行提取和净化做空白试验，以确认不含有干扰待测组分的物质。
7.结果计算
待测样品中FB1、FB2、FB3的含量按式（4-13）计算：
式中 X——待测样品中FB1、FB2、FB3的含量，μg/kg；
ρ——待测物进样液中FB1、FB2、FB3的浓度，ng/mL；
V——定容体积，mL；
f——试液稀释倍数；
m——样品的称样量，g。
（四）注意事项
1.对于每个批次的亲和柱在使用前需进行质量检验。柱容量及柱回收率验证方法如下：
（1）柱容量验证方法 在30mL的吐温－20/PBS溶液（0.1%）中加入15μg FB1标准储备溶液，充分混匀。分别取同一批次3根免疫亲和柱，每根柱的上样量为10mL（5μg FB1）。经上样、淋洗、洗脱，收集洗脱液，用氮气吹至约1mL，用乙腈－水溶液（20+80）定容至10mL，用液相色谱仪分离测定FB1的含量。
结果判定：结果FB1≥4.5μg，为柱容量满意。
（2）柱回收率验证方法 取2mL空白样品提取液，加入47mL吐温－20/PBS溶液（0.1%），加入15μg FB1标准储备溶液，用吐温－20/PBS溶液（0.1%）定容至50mL，充分混匀。分别取同一批次3根免疫亲和柱，每根柱的上样量为10mL（3μg FB1）。经上样、淋洗、洗脱，收集洗脱液，用氮气吹干至1mL，用乙腈－水溶液（20+80）定容至10mL，用液相色谱仪分离测定FB1的含量。
结果判定：结果FB1≥2.4μg，则回收率≥80%，为柱回收率满意。
2.该方法定量测定伏马毒素时，当称样量为5g时，FB1、FB2、FB3的检出限分别为17、8、8μg/kg，定量限分别为50、25、25μg/kg。
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），又称为呕吐毒素（vomintoxin），属单端孢霉烯族化合物。该毒素是镰刀菌霉（F.graminearum和F.culmorum）的二级代谢产物。它广泛存在于玉米、小麦、水稻、豆饼等粮食及饲料中。造成DON污染的主要因素受贮存时温度、湿度的影响，高湿气、低温条件下，霉菌在谷物中缓慢生长，产生镰刀菌毒素。DON一般在大麦、小麦、玉米、燕麦中含有较高的浓度，在黑麦、高粱、大米中的浓度较低。DON常常与其他真菌毒素同时存在，从谷物和饲料中分离出来的DON的最高浓度可达92mg/kg。DON含量超过1mg/kg，会对人及动物健康产生安全隐患。DON的中毒症状表现为：厌食、呕吐、消化道炎症、白血球下降、运动失调、内脏出血、中枢神经系统病变。美国食品及药物管理局（FDA）规定，食品中DON的安全标准为1mg/kg，这也是我国规定的DON限量标准。
在单端孢霉烯族化合物中，DON由于在分子结构上存在着三个羟基，为复合抗原（毒素与载体蛋白的复合物）的制备带来一定的困难。1988年，Casale等人用丁基硼酸将DON分子结构中7和15位上的两个羟基先期封闭起来，通过3位上的羟基转变成琥珀酸酐衍生物，继而实现与载体蛋白的结合。运用该方法，已制备出抗DON的单克隆抗体，并建立了小麦中测定DON的间接酶联免疫吸附测定法。根据该方法生产的试剂盒，可检测样品中百万分之一的DON残留。有关酶联免疫检测详见第五章。本实验介绍免疫亲和层析净化高效液相色谱法的测定技术。
（一）检测原理
用提取液提取样品中的DON，经免疫亲和柱净化后，用高效液相色谱分离、紫外检测器测定，外标法定量。本方法的粮食及粮食制品检出限为0.5mg/kg，酱、酒、醋等检出限为0.1mg/kg。
（二）试剂和仪器
1.试剂
①甲醇和乙腈为色谱纯，其它所用试剂均为分析纯。聚乙二醇（相对分子质量8000）。
②PBS清洗缓冲液：称取8.0g氯化铀、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.02g氯化钾，用990mL水将上述试剂溶解，然后用浓盐酸调节pH至7.0，再用水稀释至1.0L。
③DON标准储备液：准确称取一定量的DON标准品（纯度≥98%），用甲醇溶解，配成0.1mg/mL的标准储备液，在－20℃保存，可使用3个月。
④DON标准工作液：根据使用需要，准确吸取一定量的DON标准储备液，用流动相稀释，分别配成相当于0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0μg/mL的标准工作液。4℃保存，可使用7d。
2.仪器与设备(www.xing528.com)
脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱，玻璃纤维滤纸（直径11cm，孔径15μm），均质器（转速大于10000r/min），高速万能粉碎机（转速10000r/min），空气压力泵，高效液相色谱仪（配紫外检测器或二极管阵列检测器）。
（三）检测步骤
1.样品制备与提取
（1）粮食和粮食制品 将样品研磨（硬质的粮食等用高速万能粉碎机磨细并通过1.0mm孔径的试验筛），取25.00g左右磨碎的样品于100mL容量瓶中，加入5.0g聚乙二醇，用水定容至刻度，混匀，转移至均质杯中，高速搅拌2min。定量滤纸过滤后，以玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液A于干净的容器中。
（2）酒类 取脱气酒类试样（含二氧化碳的酒类样品使用前先置于4℃冰箱冷藏30min，过滤或超声脱气）或其他不含二氧化碳的酒类试样20.00g左右，加入1.0g聚乙二醇，用水定容至25.0mL，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液B于干净的容器中。
（3）酱油、醋、酱及酱制品 取样品25.00g左右，加入5.0g聚乙二醇，用水定容至100.0mL，高速搅拌提取2min，定量滤纸过滤后，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液C于干净的容器中。
2.样品净化
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取滤液A或B或C 2.0mL，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使滤液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。用5mL PBS清洗缓冲液和5mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速约为1～2滴/s，直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液，抽干小柱。
3.洗脱
准确加入1.0mL甲醇洗脱，流速约为1滴/s，收集全部洗脱液于干净的玻璃试管中，HPLC测定。
4.测定
（1）色谱参考条件 色谱柱：C18柱，5μm，150mm×4.6mm，流动相：甲醇+水（20+80），流速：0.8mL/min，柱温：35℃，进样量：50μL，检测波长：218nm。
（2）定量测定 以DON标准工作液浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对试样进行定量，标准工作溶液和试样溶液中DON的响应值均应在仪器检测线性范围内。
5.结果计算
样品中DON的含量按下式计算：
式中 X——样品中DON的含量，mg/kg；
ρ1——样品溶液中DON的浓度，μg/mL；
ρ0——空白样品溶液中DON的浓度，μg/mL；
V——甲醇洗脱液体积，mL；
m——试样的质量，g；
f——稀释倍数。
杂色曲霉毒素（sterigmatocystin，简称ST）主要是由曲霉属的某些菌种，如杂色曲霉、构巢曲霉、皱曲霉、赤曲霉、焦曲霉、爪曲霉、四脊曲霉、毛曲霉以及黄曲霉、寄生曲霉等产生的有毒代谢产物，1954年首先从杂色曲霉的培养物中分离出一种淡黄色针状结晶，并命名为杂色曲霉素，结构上与黄曲霉毒素B1非常相似，是黄曲霉毒素生物合成过程的中间体。ST在化学结构上，具有双氢呋喃苯并呋喃系统。ST的分子式C18H12O6，相对分子质量324.06，熔点246℃。可溶于大多数非极性溶剂，不溶于水，难溶于极性溶剂、氢氧化钠及碳酸钠水溶液。氯仿对ST的溶解度最大，可作为萃取ST的首选溶剂。在紫外光下具有暗砖红色荧光。
杂色曲霉在自然界分布很广，存在于乳制品、谷类和饲料中。ST主要由杂色曲霉群和构巢曲霉群的某些菌种产生。ST是一种毒性很强的肝及肾脏毒素，对实验动物均显示了强致癌性，可诱发肝癌和胃癌。杂色曲霉毒素中毒，国内又称“黄肝病”或“黄染病”。在肝癌高发区所食用的食物中，杂色曲霉素污染较为严重，可导致人类食物中毒和产生毒性损伤效应。
据报道，ST的检测方法有气相色谱法（GC）、气质联用法（GC－MS）和高效液相色谱法（HPLC）等，但现行的植物性食品中杂色曲霉素的测定还是薄层层析法（TLC）（GB/T 5009.25-2003）。本实验主要介绍薄层色谱法测定ST。
（一）检测原理
样品中的ST经提取、净化、浓缩、薄层展开后，用三氯化铝显色，再经加热产生一种在紫外光下显示黄色荧光的物质。根据其在薄层上显示的荧光最低检出量，确定样品中ST的含量。
（二）试剂及仪器
硅胶薄板、展开槽、紫外灯。
乙腈∶5%氯化钠水溶液（9∶1）、正己烷、氯仿、无水硫酸钠。
ST标准溶液的配制：准确称取ST结晶10mg，用苯定容至100mL棕色容量瓶中。分别吸取1mL和0.5mL于2个10mL棕色容量瓶中，加苯稀释至刻度，分别配成100、10、0.5μg/mL标准液。避光，4℃冰箱中保存。
（三）检测步骤
1.粗毒素的提取
取50g粉碎过20目筛的样品，加250mL乙腈∶5%氯化钠水（9∶1）溶液，振荡30min，过滤；残渣加入150mL乙腈∶5%氯化钠水溶液，振荡过滤；将2次滤液加200mL正己烷，振摇2min，静止分层，弃去正己烷层，将乙腈－水层加5%氯化钠水溶液100mL和氯仿200mL，振摇2min，静止分层，乙腈－水层加100mL氯仿，振摇分层后，弃去乙腈－水层，收集2次氯仿层加无水硫酸钠振摇、过滤、浓缩至干，得到粗毒素。
2.薄层层析
（1）点样 上述挥干物用苯或氯仿溶解后，配成苯或氯仿含量为5mg/mL粗毒素的溶液，供薄层层析用。硅胶薄层板（10cm×10cm）2块，临用前105℃活化2h；在距下端0.3～1cm基线上加样，每板加2个样点，第一点距左边缘0.8～1cm处滴加标准液（0.4μg/mL）10μL，在距左边缘4cm处滴加样液8μL，然后在第二块板的样点上加滴标准液10μL。在滴加样液时可用吹风机冷风边吹边加。
（2）展开 用双向薄层展开。
①横向展开：在展开槽内加入乙醚∶正己烷∶苯∶氯仿∶甲酸（20∶60∶10∶10∶4）溶液15mL，将上述点好的薄层板靠近左边标准点的一边从槽的斜对角位置放入展开，刚展至板端时，取出挥干。
②纵向展开：将近干的薄层板靠近标准点与样点的一边以苯∶甲醇∶乙酸溶液（90∶8∶2）15mL展开至刚到板端时，取出挥干。
（3）显荧光 于薄层板上喷20%三氯化铝（AlCl3·6H2O）乙醇溶液，迅速将板放置于80℃加热10min，取出后立即在365nm波长的紫外光下观察，待薄层板冷却后再喷第2次（不需要加热），可直接观察结果。
（4）确证实验 第一次展开后，在样品的类似杂色曲霉素的样点上，以及杂色曲霉素的标准样点上，各滴加5μL无水三氟乙酸，用苯∶甲醇（9∶1）横向展开。用20%AlCl3乙醇溶液喷雾，紫外线下观察，有无黄色荧光点，三氟乙酸与杂色曲霉素的反应物Rf值为0.3左右。
（5）样品的定量方法 按上法测得ST的Rf值约为0.6。如果在第一块薄层板上，ST标准品与样品中的ST荧光强弱相当，则样品中的ST含量为12.5ng/g。若样品中的ST的荧光比标准荧光强，则可减少样液的点加量或稀释后点样，直到样品的ST荧光点强度与ST标准一致为止，按下式计算样品中ST的含量。
式中 V——与最低检出量荧光强度相当的样液点加体积，mL；
D——样液总稀释倍数；
C——ST标准品浓度，μg/mL；
m——样品质量，kg。
本方法ST的最低检出量为0.005μg。当降低到0.002μg尚可看到，但亮黄色发暗。
（四）注意事项
（1）点样后一定等薄层板干燥后再开始层析。
（2）取样时各样品要有各自固定的微量吸管，以免样品之间互相污染。
（3）点样直径不要超过5mm，并用吹风机边吹边点。
玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN，ZEA或ZON），又称F－2毒素，是由镰刀菌属的菌种产生的代谢产物，是一种雌激素真菌毒素。最早是由染有赤霉病的玉米中分离得到的。ZEN属于雷锁酸内酯，是一种白色结晶化合物，分子式C18H22O5，相对分子质量318。不溶于水、二硫化碳和微溶于石油醚（30～60℃），溶于碱性溶液、苯、二氯甲烷、醋酸乙酯、乙腈和乙醇等。在360nm的长波紫外光下，ZEN毒素呈现蓝绿色荧光，在260nm短波紫外光下绿色荧光更强，利用此性质可用来定性鉴别F－2毒素。ZEN的耐热性较强，110℃下处理1h才能被完全破坏。
ZEN毒素的产生菌主要是镰刀菌，如禾谷镰刀菌、三线镰刀菌、尖孢镰刀菌、黄色镰刀菌、串珠镰刀菌、木贼镰刀菌、雪腐镰刀菌等。这些菌株主要存在于玉米和玉米制品中，小麦、大麦、高粱、大米中也有一定程度的分布。虫害、冷湿气候、机械损伤和贮存不当都可以诱发产生玉米赤霉烯酮。
ZEN毒素具有较强的生殖毒性和致畸作用，可引起动物发生雌激素亢进症，导致动物不孕或流产，对家禽特别是猪、牛和羊的影响较大，给畜牧业带来经济损失。食用含赤霉病麦面制作的食品也可引起中枢神经系统的中毒症状，如恶心、发冷、头疼、精神抑郁等。ZEN毒素可由口进入血液，7d内可在尿液中检出，致病机制同雌激素中毒症。我国规定ZEN毒素限量为60μg/kg。
目前ZEN毒素的测定方法有免疫亲和柱－荧光计法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法及ZEN检测试剂盒法等。本试验主要介绍的是免疫亲和柱－荧光计测定法和高效液相色谱法。
（一）免疫亲和柱－荧光计测定法
1.检测原理
试样中的ZEN毒素用一定比例的甲醇－水提取，提取液经过滤，稀释后，用亲和柱净化，以甲醇将亲和柱上的ZEN毒素淋洗下来，在淋洗液中加入显色剂，然后用荧光计进行定量测定，ZEN毒素在紫外线照射下显蓝绿色。
2.试剂及仪器
4－系列真菌毒素专用荧光计；均质器（250mL）；微量移液器（1.0mL）；涡流混合器；玻璃纤维滤纸（1.0μm）；VICAM玉米赤霉烯酮亲和柱；聚乙二醇（PEG），相对分子质量8000；甲醇及乙腈（色谱纯）；VICAMZEN衍生液；VICAM真菌毒素通用标定标准物；0.1%吐温－20/PBS缓冲液。
3.检测步骤
（1）标定值的设置 使用真菌毒素通用标定标准物，如表4-8所示。
表4-8 标色值的设置
（2）检测准备
①标定荧光计：确认延时时间为5min；1倍0.1%吐温－20/PBS缓冲液（每月配制一次）；
②提取液：乙腈∶水（90∶10，体积比），或者甲醇∶水（80∶20，体积）。
③试剂空白试验：1mL甲醇+1mL显色剂置于测试管中，荧光计读数应为0。
④空白试验：2mL纯水置于测试管中，荧光计读数应为0。
（3）样品提取与稀释 称取20g磨细的样品，2g氯化钠，置于搅拌杯中；加入50mL甲醇∶水（80∶20）溶液，或者乙腈∶水（90∶10）；盖上搅拌杯的盖子，高速搅拌2min；取下盖子，将提取物倒入折叠式滤纸上，滤液收集于干净的容器中。
吸取10mL滤液，置于干净的容器中，用40mL 1倍0.1%吐温－20/PBS缓冲液稀释，混匀；稀释液通过玻璃微纤维滤纸（1.0μm）过滤，滤液收集于玻璃注射器中。
（4）色谱柱操作与测定
①取10mL滤液以1～2滴/s的流速全部通过亲和柱，直至空气进入到亲和柱中。
②取10mL 0.1%吐温－20/PBS缓冲液以1～2滴/s的流速通过亲和柱。
③取10mL纯水以1～2滴/s的流速通过亲和柱，直至空气进入到亲和柱中。
④用1.0mL甲醇以1滴/s的流速淋洗亲和柱，将所有样品淋洗液（1mL）收集于玻璃测试管中。
⑤将1.0mL ZearalaTest显色剂加到测试管的淋洗液中。混匀后，将测试管置于已标定好的荧光计中。5min后，读数。
4.注意事项
（1）此方法的检测限为0.1mg/kg，测定范围0～5.0mg/kg。
（2）当测定浓度在5.0mg/kg以上时，应加以稀释。
（二）免疫亲和层析净化－高效液相色谱法
1.检测原理
用提取液提取样品中的ZEN，经免疫亲和柱净化后，用高效液相色谱荧光检测器测定，外标法定量。本方法（GB/T 23504-2009）适用于粮食和粮食制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品中玉米赤霉烯酮含量的测定，检出限：粮食等为20μg/kg，酱油醋等为50μg/kg。
2.试剂和仪器
（1）试剂 甲醇、乙腈为色谱纯，其他为分析纯。
提取液：乙腈+水（9+1）。PBS清洗缓冲液：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾，用990mL水将上述试剂溶解，然后用浓盐酸调节pH至7.0，再用水定容至1L。
ZEN标准储备液：准确称取一定量的ZEN标准品（纯度≥98%），用甲醇+乙腈（1+1）溶解，配成0.1mg/mL的标准储备液，在－20℃保存，可使用3个月。ZEN标准工作液：根据使用需要，准确吸取一定量的ZEN储备液，用流动相稀释，分别配成相当于10、50、100、200、500ng/mL的标准工作液，4℃保存，可使用7d。
（2）仪器与设备 ZEN免疫亲和柱，玻璃纤维滤纸（直径11cm，孔径1.5μm，无荧光特性），均质器（转速大于10000r/min），高速万能粉碎机（转速10000r/min），试验筛（1mm孔径），高效液相色谱仪（配有荧光检测器）。
3.检测步骤
（1）样品制备与提取
①粮食和粮食制品：将样品研磨（硬质的粮食等用高速万能粉碎机磨细并通过试验筛）。称取50.00g磨碎的试样于100mL容量瓶中，加入5g氯化钠，用提取液定容，混匀，转移至均质杯中，高速搅拌提取2min。定量滤纸过滤，移取10.0mL滤液于50mL容量瓶中，加水定容，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液A于干净的容器中。
②酒类：取脱气酒类样品（含CO2的酒类使用前先置于4℃冰箱冷藏30min，过滤或超声脱气）或其他不含CO2的酒类试样20.00g左右于50mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀。移取10.0mL滤液于50mL容量瓶中，加水定容，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液B于干净的容器中。
③酱油、醋、酱及酱制品：取25.00g左右混匀的试样，用乙腈定容至100.0mL，超声提取2min，定量滤纸过滤，移取10.0mL滤液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液C于干净的容器中。
（2）提取 将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取滤液A或B或C 10.0mL，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。依次用10mL PBS清洗缓冲液（pH4.4）和10mL水淋洗免疫亲和柱，流速约为1～2滴/s，直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液，抽干小柱。
准确加入1.0mL甲醇洗脱，流速约为1滴/s，收集全部洗脱液于干净的玻璃试管中，用甲醇定容至1.0mL，HPLC测定。
（3）测定
①高效液相色谱参考条件：色谱柱：C18柱，5μm，150mm×4.6mm；流动相：乙腈+水+甲醇（46+46+8）；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；进样量：20～100μL；检测波长：激发波长274nm，发射波长440nm。
②定量测定：以ZEN标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对试样进行定量。
4.结果计算
试样中ZEN的含量按下式计算：
式中 X——试样中ZEN的含量，μg/kg；
ρ1——试样溶液中ZEN的浓度，ng/mL；
ρ0——空白试样溶液中ZEN的浓度，ng/mL；
V——甲醇洗脱液体积，mL；
m——试样的质量，g；
f——稀释倍数。
T－2毒素主要是三线镰刀菌产生的单端孢霉烯族化合物（trichothecenes，TS）之一，化学名称为4，15－二乙酰氧基－8－（异戊酰氧基）－12，13－环氧单端孢霉－9－烯－3－醇。到目前为止，从真菌培养物及植物中已分离出化学结构基本相同的单端孢霉烯族化合物148种。T－2毒素为无色针状结晶，熔点为150～151℃，相对分子质量466.51，该化合物非常稳定，在正常条件下，可长期贮存而不变质。T－2毒素难溶于水，易溶于极性溶剂，如三氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯等。在烹调过程中不易被破坏。T－2毒素基本结构为四环的倍半萜，C9和C10位上有一不饱和双键，在紫外线下不显荧光。
大多数单端孢霉烯族化合物是由镰刀菌属的菌种产生的，镰刀菌属的菌种广泛分布于自然界，这些真菌及其毒素主要侵害玉米、小麦、大米、燕麦、大麦等谷物，是食品或饲料中最严重污染物，也是毒性最强的真菌毒素之一。人畜误食该毒素污染的谷物后，可引起恶心、呕吐、头痛、腹泻、腹痛等急性中毒症状，导致骨髓组织的坏死和内脏器官出血，引起心肌受损，皮肤组织坏死，破坏造血组织和免疫抑制。能扰乱中枢神经系统，阻碍DNA和RNA的合成，导致遗传毒性及致死。T－2毒素的主要毒性作用为细胞毒性，免疫抑制和致畸作用，甚至还有很高的致癌性。我国于1996年就制订了小麦、玉米及其制品中T－2毒素的限量标准为≤1000μg/kg。
T－2毒素的检测方法主要有薄层色谱法、气相色谱法、酶联免疫吸附法、免疫亲和柱－荧光计法。本实验主要介绍免疫亲和柱－荧光计测定法。
（一）检测原理
试样中的T－2毒素用甲醇提取后，提取液经过滤，稀释后，加入T－2毒素衍生液，以甲醇将亲和柱上的T－2毒素淋洗后收集于小试管中，用荧光计进行测定，T－2毒素在紫外灯下不显荧光。
（二）试剂和仪器
1.试剂
甲醇（色谱级）；PBS缓冲液；氯化钠；VICAMT－2毒素衍生液；VICAMT－2毒素标定用溶液；0.02%吐温/PBS缓冲液：0.1mL吐温－20+9.9mL PBS缓冲液+490mL水。
2.仪器
4－系列真菌毒素专用荧光计；均质器（250mL）；微量移液器（0.5mL）；涡流混合器；塑料注射器（60mL）；VICAMT－2毒素亲和柱；聚乙二醇（PEG），相对分子质量8000。
（三）检测步骤
1.样品提取
称取50g样品、5g氯化钠、10g PEG置于均质杯中，加入150mL 25%的甲醇，高速均质1min。用折叠式滤纸过滤，收集25mL滤液于干净的烧杯中，用25mL水将滤液稀释一倍。将T－2毒素亲和柱与塑料注射器相连，取40mL T－2毒素标定用溶液加入到塑料注射器中。
2.样品制备
在塑料注射器中加入0.5mL的T－2毒素衍生液，用硅胶塞塞好，重复振摇4～5次，然后再置于操作架上。
3.色谱柱分离与测定
将空气泵与亲和柱相连，使注射器中的溶液以1～2滴/s的速度通过亲和柱。用0.02%吐温/PBS缓冲液以1～2滴/s的速度通过亲和柱；用2mL色谱级的甲醇以1滴/s的速度通过亲和柱，滤液收集于测试管中，将测试管置于荧光计中进行测定。
（四）注意事项
（1）色谱柱分离时，提取液通过亲和柱的流速要严格控制，否则结果影响荧光计测定。
（2）此方法的检测限为0.15mg/kg，测定范围为0～5.0mg/kg。
展青霉素纯品为无色结晶，分子式C7H6O4，相对分子质量154，熔点110℃，在70～100℃可真空升华，能溶于水和乙醇，在碱性条件下不稳定，在酸性条件下稳定，耐热。展青霉素能改变细胞膜的通透性，利于K+外流；展青霉素可与巯基基团结合，抑制含巯基基团的酶活性；展青霉素对免疫系统也有影响。
青霉、扩张青霉、棒状青霉、荨麻青霉等是展青霉素的产生真菌，当水果受上述真菌污染时，水果及水果制品中均会检出该毒素。我国在20世纪90年代曾调查过水果半制品，检出率达到76.9%。鉴于展青霉素毒性及其污染状态，有不少国家制定了水果制品最高限量标准，一般为50μg/kg。我国规定水果半成品为100μg/kg，果汁、果酒、水果罐头为50μg/kg。
展青霉素的检测方法有薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法及展青霉素试剂盒等。本书介绍展青霉素的高效液相色谱法。
（一）检测原理
试样中的展青霉素用乙腈提取后，提取液经净化柱净化后，在高效液相色谱柱上分离后，以紫外检测器于276nm处检测，外标法定量。
（二）试剂及仪器
甲醇、乙腈（均为色谱纯）；Millipore超纯水；果胶酶（Pectinase，EC 232-885-6），活性不低于1500U/g。
展青霉素标准液：准确移取1.00mL展青霉素标准物质乙腈溶液（100μg/mL），用乙腈稀释定容至10mL，混匀。该标准液质量浓度10.00μg/mL。
羟甲基糠醛标准液：准确称取羟甲基糠醛标准物质（质量分数≥99.0%）0.02g，溶解于10mL甲醇，用水稀释定容至100mL，再用水稀释10倍，混匀。该标准液质量浓度20.0μg/mL。
展青霉素－羟甲基糠醛混合标准工作液：分别取展青霉素标准液和羟甲基糠醛标准液各1.00mL于容量瓶中，氮气吹至近干，用流动相稀释定容至10mL。混合标准液展青霉素质量浓度1.00μg/mL，羟甲基糠醛质量浓度2.00μg/mL。
高效液相色谱仪，配有四元泵、在线脱气机、柱温箱、紫外检测器和色谱工作站；涡流混合器；净化柱：Mycrosep®228AflaPat柱或相当者。
（三）检测步骤
1.液体试样制备
移取4mL待测样于具塞量筒中，加入21mL乙腈，涡旋振荡器振荡2min后，静置分层，收集上层清液。
2.半固体、固体试样制备
半固体样品匀浆、固体试样粉碎后，称取4g于具塞量筒中，加入4mL水、75μL果胶酶，室温下放置过夜（或40℃下放置2h）。加入21mL乙腈，涡旋振荡器振荡1min后，静置分层，收集上层清液。
3.净化
移取约8mL提取液，过Mycrosep®228AflaPat净化柱，收集净化液，准确移取4mL于试管中，40℃下用氮气吹至近干（留约2μL样液）。加入0.4mL流动相，混匀，0.45μm滤膜过滤后，上机测定。
4.测定
测定条件：色谱柱Kromasil C18（长250mm，内径4.6mm，粒径5μm），流动相四氢呋喃溶液（体积比0.8∶100），色谱柱柱温30℃，流速1.0mL/min，检测波长276nm。先测定展青霉素－羟甲基糠醛混合标准工作液，以浓度与测量峰面积或峰高，绘制标准曲线。然后在上述同样条件下，取10μL样品处理液进样分析，测量保留时间、峰面积或峰高，与标准比较进行定性定量分析。
（四）注意事项
（1）Mycrosep®228AflaPat是一种净化柱商品名，柱内填硅藻土、硅胶、无水硫酸钠等。可用相当者代替。
（2）羟甲基糠醛是果汁中己酮糖在酸性或高温环境下脱水形成的产物，是苹果汁中的常见物质。由于甲基糠醛与展青霉素均带有羟基，结构相似，在苹果汁中展青霉素的提取、净化过程中两者很难分离，羟甲基糠醛成为检测展青霉素时最常见、最易混淆的干扰物。因此，检测过程中有效地分离羟甲基糠醛是检测果汁中展青霉素的必要条件。试验中直接选用展青霉素－羟甲基糠醛混合标准工作液进样来衡量色谱分离效果。在上述条件下，羟甲基糠醛与展青霉素的保留时间分别约为7.8min和10.1min。
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