测定食品防腐剂含量的方法优化

食品防腐剂是防止食品腐败变质、延长食品储存期的物质。是一类以保持食品原有性质和营养价值为目的的食品添加剂。

食品防腐剂的种类很多，我国GB 2760-2014中公布的食品防腐剂约有27类。但目前食品中应用的较多的有山梨酸、苯甲酸及其盐类，另外，还有对羟基苯甲酸酯、脱氢乙酸、丙酸钠及丙酸钙等。

按照食品安全国家标准5009.28-2016规定，食品中苯甲酸、山梨酸有两种测定方法，方法一为液相色谱法，与食品中糖精钠同时测定。具体方法详见第四节食品中糖精钠的测定。这里介绍气相色谱法测定苯甲酸和山梨酸的方法。

（一）原理

试样经盐酸酸化后，用乙醚提取苯甲酸、山梨酸，用气相色谱－氢火焰离子化检测器分离测定，外标法定量。

（二）试剂和仪器

1.试剂

①乙醚、乙醇、正己烷、乙酸乙酯。

②盐酸溶液（1+1）：取50mL盐酸，边搅拌边慢慢加入到50mL水中，混匀。

③氯化钠溶液（40g/L）：称取40g氯化钠，用适量水溶解，加盐酸溶液2mL，加水定容到1L。

④正己烷－乙酸乙酯混合溶液（1+1）：取100mL正己烷和100mL乙酸乙酯，混匀。

⑤无水硫酸钠：500℃烘8h，于干燥器中冷却至室温后备用。

⑥苯甲酸、山梨酸标准储备液（1000mg/L）：分别准确称取苯甲酸钠和山梨酸钾标准品（纯度≥99.0%）各0.1g（精确到0.0001g），用甲醇溶解并分别定容至100mL。转移至密闭容器中，于－18℃贮存，保存期为6个月。

⑦苯甲酸、山梨酸标准中间液（200mg/L）：分别准确吸取苯甲酸、山梨酸标准储备液各10.0mL于50mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容。转移至密闭容器中，于－18℃贮存，保存期为3个月。

⑧苯甲酸、山梨酸混合标准系列工作溶液：分别准确吸取苯甲酸、山梨酸混合标准中间溶液0、0.05、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.0mL，用正己烷－乙酸乙酯混合溶剂（1+1）定容至10mL，配制成质量浓度分别为1、1.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100、200mg/L的混合标准系列工作溶液。临用现配。

2.仪器

①气相色谱仪：带有氢火焰离子化检测器。

②分析天平：感量为0.001g和0.0001g。

③涡旋振荡器、匀浆机、氮吹仪。

④离心机：转速＞8000r/min

（三）测定步骤

1.试样制备

取多个预包装的样品，均匀样品直接混合，非均匀样品用组织匀浆机充分搅拌均匀，取其中的200g装入洁净的玻璃容器中，水溶液于4℃保存，其他试样于－18℃保存。

2.试样提取

准确称取约2.5g（精确至0.001g）试样于50mL离心管中，加0.5g氯化钠、0.5mL盐酸溶液（1+1）和0.5mL乙醇，用15mL和10mL乙醚提取两次，每次振摇1min，于8000r/min离心3min。每次均将上层乙醚提取液通过无水硫酸钠滤入25mL容量瓶中。加乙醚清洗无水硫酸钠层，并收集至约25mL刻度，最后用乙醚定容，混匀。准确吸取5mL乙醚提取液于5mL具塞刻度试管中，于35℃氮吹至干，加入2mL正己烷－乙酸乙酯（1+1）混合溶液溶解残渣，待气相色谱测定。

3.色谱条件

色谱柱：聚乙二醇毛细管气相色谱柱，内径320μm，长30m，膜厚度0.25μm，或等效色谱柱。

载气：氮气，流速3mL/min；空气：400L/min；氢气：40L/min。

进样口温度：250℃；检测器温度：250℃。

柱温程序：初始温度80℃，保持2min，以15℃/min的速率升温至250℃，保持5min。

进样量：2μL；分流比：10∶1。

4.标准曲线制作

将混合标准系列工作液分别注入气相色谱仪中，以质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

5.试样溶液的测定

将试样溶液注入气相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到待测液中苯甲酸、山梨酸的质量浓度。

（四）结果计算

式中 X——试样中待测组分含量，g/kg；

ρ——由标准曲线得出的样液中待测物质的质量浓度，mg/L；

V——加入正己烷－乙酸乙酯（1+1）混合溶剂的体积，mL；

25——试样乙醚提取液的总体积，mL；

m——试样的质量，g；

5——测定时吸取乙醚提取液的体积，mL；

1000——由mg/kg转换为g/kg的换算因子。

结果保留三位有效数字。精密度要求在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

2017年3月1日开始实施的GB 5009.31-2016《食品安全国家标准 食品中对羟基苯甲酸酯类的测定》规定了酱油、醋、饮料及果酱中对羟基苯甲酸酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯的测定。

（一）测定原理

试样酸化后，对羟基苯甲酸酯类用乙醚提取，浓缩近干用乙醇复溶，并用氢火焰离子化检测器气相色谱法进行分离测定，保留时间定性，外标法定量。

（二）试剂和仪器

1.试剂

①无水乙醚（C₂H₅OC₂H₅）：重蒸；无水乙醇（C₂H₅OH）：优级纯；无水硫酸钠。

②饱和氯化钠溶液：称取40g氯化钠加100mL水充分搅拌溶解。

③碳酸氢钠溶液（10g/L）：称取1g碳酸氢钠，溶于水并稀释至100mL。

④盐酸溶液（1∶1）：取50mL盐酸，用水稀释至100mL。

⑤对羟基苯甲酸酯类标准储备液（1.00mg/mL）：准确称取对羟基苯甲酸甲酯（纯度≥99.8%）、对羟基苯甲酸乙酯（纯度≥99.7%）、对羟基苯甲酸丁酯（纯度≥99.7%）、对羟基苯甲酸丙酯（纯度≥99.3%）标准物质各0.0500g分别放置于50.0mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度，置4℃左右冰箱保存，可保存1个月。

⑥对羟基苯甲酸酯类标准中间液（100μg/mL）：分别准确吸取上述对羟基苯甲酸酯类标准储备液1.0mL于10.0mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。临用时配制。

⑦对羟基苯甲酸酯类标准工作液1～5：分别吸取上述对羟基苯甲酸酯类标准中间液0.40、1.0、2.0、5.0、10.0mL于10.0mL容量瓶中，用无水乙醇稀释并定容。此即为4.0、10.0、20.0、50.0、100μg/mL的标准工作液1～5，临用时配制。

⑧对羟基苯甲酸酯类标准工作液6和标准工作液7（200μg/mL和300μg/mL）：分别吸取对羟基苯甲酸酯类标准储备液2.0mL和3.0mL于10.0mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。临用时配制。

2.仪器

气相色谱仪：具有氢火焰离子化检测器（FID）；天平：感量0.1mg和1mg；旋转蒸发仪、涡旋混匀器。

（三）测定步骤

1.取样及处理

①酱油、醋、饮料：称取5g（精确至0.001g）摇匀后的试样于小烧杯中，转移至125mL分液漏斗中，用10mL饱和氯化钠溶液分次洗涤小烧杯，合并洗涤液于125mL分液漏斗，加入1mL 1∶1盐酸酸化，摇匀，分别以75、50、50mL无水乙醚提取三次，每次2min，放置片刻，弃去水层，合并乙醚层于250mL分液漏斗中，加入10mL饱和氯化钠溶液洗涤一次，再分别以碳酸氢钠溶液30、30、30mL洗涤三次，弃去水层。用滤纸吸去漏斗颈部水分，将有机层经过无水硫酸钠（约20g）滤入浓缩瓶中，在旋转蒸发仪上浓缩近干，用氮气除去残留溶剂，准确加入2.0mL无水乙醇溶解残留物，供气相色谱用。

②果酱：称取5g（精确至0.001g）事先均匀化的果酱试样于100mL具塞试管中，加入1mL 1∶1盐酸酸化，10mL饱和氯化钠溶液，涡旋混匀1～2min，使其为均匀溶液，再分别以50、30、30mL无水乙醚提取三次，每次2min，用吸管转移至250mL分液漏斗中，加入10mL饱和氯化钠溶液洗涤一次，再分别以碳酸氢钠溶液30、30、30mL洗涤三次，弃去水层。用滤纸吸去漏斗颈部水分，将有机层经过无水硫酸钠（约20g）滤入浓缩瓶中，在旋转蒸发仪上浓缩近干，用氮气除去残留溶剂，准确加入2.0mL无水乙醇溶解残留物，供气相色谱用。

2.色谱条件

色谱柱：弱极性石英毛细管柱，柱固定液为（5%）苯基－（95%）甲基聚硅氧烷，30m×0.32mm（内径），0.25μm（膜厚）或等效柱。

程序升温条件（如表3-4所示）：

表3-4 程序升温条件

进样口：温度220℃；进样量1L，分流比10∶1（分流比可根据色谱条件调整）。

检测器：氢火焰离子化检测器（FID），温度260℃。

载气：氮气，纯度99.99%，流量2.0mL/min，尾吹30mL/min（载气流量大小可根据仪器条件进行调整）。

氢气：40mL/min；空气：450mL/min（氢气、空气流量大小可根据仪器条件进行调整）。

3.标准曲线制作

将1.0μL的标准系列工作液分别注入气相色谱仪中，测定相应的不同浓度标准的峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

4.试样溶液测定

将1.0μL的试样溶液注入气相色谱仪中，以保留时间定性，得到相应的峰面积，根据标准曲线得到待测液中组分浓度；试样待测液响应值若超出标准曲线线性范围，应用乙醇稀释后再进样分析。

（四）结果计算

试样中对羟基苯甲酸含量按下式计算：

式中 X——试样中对羟基苯甲酸的含量，g/kg；

ρ——由标准曲线计算出进样液中对羟基苯甲酸酯类的浓度，μg/mL；

V——定容体积，mL；

f——对羟基苯甲酸酯类转换为对羟基苯甲酸的换算系数；

m——试样质量，g。

对羟基苯甲酸甲酯转换为对羟基苯甲酸的换算系数为0.9078；对羟基苯甲酸乙酯转换为对羟基苯甲酸的换算系数为0.8312；对羟基苯甲酸丙酯转换为对羟基苯甲酸的换算系数为0.7665；对羟基苯甲酸丁酯转换为对羟基苯甲酸的换算系数为0.7111。

结果保留三位有效数字，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%。

GB 5009.121-2016规定了两种检测脱氢乙酸的方法：气相色谱法和液相色谱法。这两种方法均适用于果蔬汁、果蔬浆、酱菜、发酵豆制品、黄油、面包、糕点、烘烤食品馅料、复合调味料、预制肉制品及熟肉制品中脱氢乙酸含量的测定。

（一）气相色谱法

1.测定原理

固体（半固体）样品，经沉降蛋白、脱脂酸化后，用乙酸乙酯提取；果蔬汁、果蔬浆样品经酸化后，用乙酸乙酯提取；用配氢火焰离子化检测器的气相色谱仪分离测定，以色谱峰的保留时间定性，外标法定量。

2.试剂和溶液

①乙酸乙酯（C₄H₈O₂）：色谱纯；正己烷（C₆H₁₄）：色谱纯。

②盐酸溶液（1+1，体积比）：量取50mL盐酸加入到50mL水中。

③硫酸锌溶液（120g/L）：称取12g硫酸锌，溶于水并稀释至100mL。

④氢氧化钠溶液（20g/L）：称取2g氢氧化钠，溶于水并稀释至100mL。

⑤脱氢乙酸标准储备液（1.0mg/mL）：准确称取脱氢乙酸标准品（纯度≥99.5%）0.1000g（精确至0.0001g）于100mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容。4℃保存，有效期为3个月。

⑥脱氢乙酸标准工作液：分别精确吸取脱氢乙酸标准贮备液0.01、0.1、0.5、1.0、2.0mL于10mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀释并定容，配制成浓度为1.00、10.0、50.0、100、200μg/mL标准工作液。4℃保存，有效期为1个月。

3.仪器和设备

①气相色谱仪：配氢火焰离子化检测器。

②天平：感量为0.1mg和1mg；离心机：转速≥4000r/min；超声波清洗器：功率35kW。

③粉碎机、不锈钢高速均质器、pH计。

4.测定步骤

（1）样品处理

①果蔬汁、果蔬浆：称取样品2～5g（精确至0.001g），置于50mL离心管中，加10mL水振摇1min，加1mL盐酸溶液酸化后，准确加入5.0mL乙酸乙酯，振摇提取2min，静置分层，取上清液供气相色谱测定。

②酱菜、发酵豆制品：样品用不锈钢高速均质器均质。称取样品2～5g（精确至0.001g），置于50mL离心管中，加入约15mL水、2.5mL硫酸锌溶液，用氢氧化钠溶液调pH至7.5，超声提取15min，转移至25mL容量瓶中，加水定容。样液移入离心管中，4000r/min离心10min。取10mL上清液，加1mL盐酸溶液酸化后，准确加入5.0mL乙酸乙酯，振摇2min，静置分层，取上清液供气相色谱测定。

③面包、糕点、烘烤食品馅料、复合调味料、预制肉制品及熟肉制品：样品用粉碎机粉碎或不锈钢高速均质器均质。称取样品2～5g（精确至0.001g），置于50mL离心管中，加入约15mL水、2.5mL硫酸锌溶液，用氢氧化钠溶液调pH至7.5，超声提取15min，转移至25mL容量瓶中，加水定容。样液移入分液漏斗中，加入5mL正己烷，振摇1min，静置分层，取下层水相置于离心管中，4000r/min离心10min。取10mL上清液，加1mL盐酸溶液酸化后，准确加入5.0mL乙酸乙酯，振摇2min，静置分层，取上清液供气相色谱测定。

④黄油：称取样品2～5g（精确至0.001g），置于50mL离心管中，加入约15mL水、2.5mL硫酸锌溶液，用氢氧化钠溶液调pH至7.5，超声提取15min，转移至25mL容量瓶中，加水定容。样液移入分液漏斗中，加入5mL正己烷，振摇1min，静置分层，取下层水相置于离心管中，4000r/min离心10min。取10mL上清液，加1mL盐酸溶液酸化后，准确加入5.0mL乙酸乙酯，振摇2min，静置分层，取上清液供气相色谱测定。

（2）色谱条件

①毛细管柱：极性毛细柱（化学键和聚乙二醇固定相，30m×0.32mm×0.25μm），或相当者。

②柱温升温程序：初温150℃，以10℃/min速率升至210℃，20℃/min速率升至240℃，保持2min。

③进样口温度：240℃；检测器温度：300℃。

④载气（N₂）流量：1.0mL/min。

⑤分流进样，分流比为5∶1，进样体积1.0μL。

（3）测定步骤

①标准曲线制作：将脱氢乙酸标准工作液分别注入气相色谱仪中，测定相应峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

②样品测定：将测定溶液注入气相色谱仪中，以保留时间定性，同时记录峰面积，根据标准曲线得到测定溶液中的脱氢乙酸浓度。

③空白试验：除不加试样外，空白试验应与样品测定平行进行，并采用相同的分析步骤分析。(www.xing528.com)

5.结果计算

果蔬汁、果蔬浆试样中脱氢乙酸含量按式（3-17）计算：

其他试样中脱氢乙酸含量按式（3-18）计算：

式中 X₁——试样中脱氢乙酸的含量，g/kg；

ρ₁——试样溶液中脱氢乙酸的质量浓度，μg/mL；

ρ₀——空白试样溶液中脱氢乙酸的质量浓度，μg/mL；

V——乙酸乙酯定容体积，mL；

m——称取试样的质量，g；

X₂——试样中脱氢乙酸的含量，g/kg；

V₁——试样处理后定容体积，mL；

V₂——萃取脱氢乙酸所取试样液体积，mL。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

（二）液相色谱法

1.试验原理

用氢氧化钠溶液提取试样中的脱氢乙酸，经脱脂、去蛋白处理，过膜，用配紫外或二极管阵列检测器的高效液相色谱仪测定，以色谱峰的保留时间定性，外标法定量。

2.试剂和溶液

①甲醇（CH₄O）：色谱纯；正己烷（C₆H₁₄）。

②乙酸铵溶液（0.02mol/L）：称取1.54g乙酸铵，溶于水并稀释至1L。

③氢氧化钠溶液（20g/L）：称取20g氢氧化钠，溶于水并稀释至1L。

④甲酸溶液（10%）：量取10mL甲酸，加水90mL，混匀。

⑤硫酸锌溶液（120g/L）：称取120g硫酸锌，溶于水并稀释至1L。

⑥甲醇溶液（70%）：量取70mL甲醇，加水30mL，混匀。

⑦脱氢乙酸标准储备液（1.0mg/mL）：准确称取脱氢乙酸标准品（纯度≥99.5%）0.1000g（精确至0.0001g）于100mL容量瓶中，用10mL氢氧化钠溶液溶解，用水定容。4℃保存，有效期为3个月。

⑧脱氢乙酸标准工作液：分别吸取脱氢乙酸标准贮备液0.1、1.0、5.0、10、20mL于100mL容量瓶中，用水定容，配制成浓度为1.00、10.0、50.0、100、200μg/mL标准工作液。4℃保存，有效期为1个月。

3.仪器和设备

①高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。

②分析天平：感量为0.1mg和1mg。

③粉碎机、不锈钢高速均质器、涡旋混合器、pH计。

④超声波清洗器：功率35kW。

⑤离心机：转速≥4000r/min。

⑥C₁₈固相萃取柱：500mg，6mL（使用前用5mL甲醇、10mL水活化，使柱子保持湿润状态）。

4.测定步骤

（1）样品处理

①果蔬汁、果蔬浆：称取样品2～5g（精确至0.001g），置于50mL离心管中，加入约10mL水，用氢氧化钠溶液调pH至7.5，转移至50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。置于离心管中，4000r/min离心10min。取20mL上清液用10%的甲酸溶液调pH至5，定容到25mL。取5mL过已活化固相萃取柱，用5mL水淋洗，2mL 70%的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液2mL，涡旋混合，过0.45μm有机滤膜，供高效液相色谱测定。

②酱菜、发酵豆制品：样品用不锈钢高速均质器均质。称取样品2～5g（精确至0.001g），置于25mL离心管中，加入约10mL水、5mL硫酸锌溶液，用氢氧化钠溶液调pH至7.5，转移至25mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。置于25mL离心管中，超声提取10min，4000r/min离心10min，取上清液过0.45μm有机滤膜，供高效液相色谱测定。

③面包、糕点、焙烤食品馅料、复合调味料：样品用粉碎机粉碎或不锈钢高速均质器均质。称取样品2～5g（精确至0.001g），置于25mL离心管（如需过固相萃取柱则用50mL离心管）中，加入约10mL水、5mL硫酸锌溶液，用氢氧化钠溶液调pH至7.5，转移至25mL容量瓶（如需过固相萃取柱则用50mL容量瓶）中，加水稀释至刻度，摇匀。置于离心管中，超声提取10min，转移到分液漏斗中，加入10mL正己烷，振摇1min，静置分层，弃去正己烷层，加入10mL正己烷重复进行一次，取下层水相置于离心管中，4000r/min离心10min。取上清液过0.45μm有机滤膜，供高效液相色谱测定。若高效液相色谱分离效果不理想，取20mL上清液，用10%的甲酸调pH至5，定容到25mL，取5mL过已活化的固相萃取柱，用5mL水淋洗，2mL 70%的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液2mL，涡旋混合，过0.45μm有机滤膜，供高效液相色谱测定。

④黄油：称取样品2～5g（精确至0.001g），置于25mL离心管（如需过固相萃取柱则用50mL离心管）中，加入约10mL水、5mL硫酸锌溶液，用氢氧化钠溶液调pH至7.5，转移至25mL容量瓶（如需过固相萃取柱则用50mL容量瓶）中，加水稀释至刻度，摇匀。置于离心管中，超声提取10min，转移到分液漏斗中，加入10mL正己烷，振摇1min，静置分层，弃去正己烷层，加入10mL正己烷重复进行一次，取下层水相置于离心管中，4000r/min离心10min。取上清液过0.45μm有机滤膜，供高效液相色谱测定。若高效液相色谱分离效果不理想，取20mL上清液，用10%的甲酸调pH至5，定容到25mL，取5mL过已活化的固相萃取柱，用5mL水淋洗，2mL70%的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液2mL，涡旋混合，过0.45μm有机滤膜，供高效液相色谱测定。

（2）色谱参考条件 色谱柱：C₁₈柱，5μm，250mm×4.6mm（内径）或相当者。流动相：甲醇+0.02mol/L乙酸铵（10+90，体积比）；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：293nm。

（3）测定

①标准曲线制作：将脱氢乙酸标准工作液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

②样品测定：将测定溶液注入液相色谱仪中，测得相应峰面积，根据标准曲线得到测定溶液中的脱氢乙酸浓度。

③空白试验：除不加试样外，空白试验应与样品测定平行进行，并采用相同的分析步骤分析。

5.结果计算

式中 X——试样中脱氢乙酸的含量，g/kg；

ρ₁——试样溶液中脱氢乙酸的质量浓度，μg/mL；

ρ₀——空白试样溶液中脱氢乙酸的质量浓度，μg/mL；

V——试样溶液总体积，mL；

f——过固相萃取柱换算系数（f=0.5）；

m——称取试样的质量，g。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

GB/T 5009.20-2016于2017年3月1日正式实施，标准规定了豆类制品、生湿面制品、面包、糕点、醋、酱油中丙酸钠、丙酸钙测定的液相色谱和气相色谱两种方法。同时代替了GB/T 5009.120-2003《食品中丙酸钠、丙酸钙的测定》和GB/T 23382-2009《食品中丙酸钠、丙酸钙的测定 高效液相色谱法》。

（一）液相色谱法

1.测定原理

试样中的丙酸盐通过酸化转化为丙酸，经超声波水浴提取或水蒸气蒸馏，收集后调pH，经高效液相色谱测定，外标法定量其中丙酸的含量。样品中的丙酸钠和丙酸钙以丙酸计，需要时可根据相应参数分别计算丙酸钠和丙酸钙的含量。

2.试剂和溶液

①硅油。

②磷酸溶液（1mol/L）：在50mL水中加入53.5mL磷酸，混匀后，加水定容至1000mL。

③磷酸氢二铵溶液（1.5g/L）：称取磷酸氢二铵1.5g，加水溶解定容至1000mL。

④丙酸标准储备液（10mg/mL）：精确称取250.0mg丙酸标准品（纯度≥97.0%）于25mL容量瓶中，加水至刻度，4℃冰箱中保存，有效期为6个月。

3.仪器和设备

①高效液相色谱（HPLC）仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。

②天平：感量0.0001g和0.01g。

③超声波水浴；离心机：转速不低于4000r/min；组织捣碎机、50mL具塞塑料离心管、500mL水蒸气蒸馏装置、鼓风干燥箱、pH计。

4.测定步骤

（1）样品处理 固体样品经组织捣碎机捣碎混匀后备用（面包样品在37℃下鼓风干燥2～3h进行，置于组织捣碎机中磨碎），液体样品摇匀后备用。

①豆类制品、生湿面制品、醋、酱油等样品采用蒸馏法处理：样品均质后，准确称取25g（精确至0.01g），置于500mL蒸馏瓶中，加入100mL水，再用50mL水冲洗容器，转移到蒸馏瓶中，加1mol/L磷酸溶液20mL，2～3滴硅油，进行水蒸气蒸馏，将250mL容量瓶置于冰浴中作为吸收液装置，待蒸馏至约240mL时取出，在室温下放置30min，用1mol/L磷酸溶液调pH为3左右，加水定容至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤后，待液相色谱测定。

②面包、糕点等样品用直接浸提法处理：准确称取5g（精确至0.01g）试样至100mL烧杯中，加水20mL，加入1mol/L磷酸溶液0.5mL，混匀，经超声浸提10min后，用1mol/L磷酸溶液调pH为3左右，转移试样至50mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。将试样全部转移至50mL具塞塑料离心管中，以不低于4000r/min离心10min，取上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤后，待液相色谱测定。

（2）色谱条件

①色谱柱：C₁₈柱，4.6mm×250mm，5μm或等效色谱柱。

②流动相：1.5g/L磷酸氢二铵溶液，用1mol/L磷酸溶液调pH为2.7～3.5（使用时配制），经0.45μm微孔滤膜过滤。

③流速：1.0mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL；波长：214nm。

（3）色谱柱清洗参考条件 实验结束后，用10%甲醇清洗1h，再用100%甲醇清洗1h。

（4）标准曲线绘制

①蒸馏法：准确吸取标准储备液0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5mL置于500mL蒸馏瓶中，其他操作同样品处理，其丙酸标准溶液的最终浓度分别为0.02、0.04、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，浓度由低到高进样，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

②直接浸提法：准确吸取5.0mL标准储备液于50mL容量瓶中，用水稀释至刻度，配制成浓度为1.0mg/mL标准工作液。再准确吸取标准工作液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL至10mL容量瓶中，分别加入1mol/L磷酸0.2mL，用水定容至10mL，混匀。其丙酸标准溶液的最终浓度分别为0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，浓度由低到高进样，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

（5）试样溶液的测定 处理后的样液同标准系列同样进机测试。根据标准曲线计算样品中的丙酸浓度。若待测样液中丙酸响应值超出标准曲线浓度线性范围则应稀释后再进样分析。

5.结果计算

式中 X——样品中丙酸钠（钙）含量（以丙酸计），g/kg；

ρ——由标准曲线得出的样液中丙酸的浓度，mg/mL；

V——样液最后定容体积，mL；

m——样品质量，g；

f——稀释倍数。

试样中测得的丙酸含量乘以换算系数1.2967，即得丙酸钠的含量；试样中测得的丙酸含量乘以换算系数1.2569，即得丙酸钙含量。

计算结果保留三位有效数字。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

（二）气相色谱法

1.测定原理

试样中的丙酸盐通过酸化转化为丙酸，经水蒸气蒸馏收集后直接进气相色谱，用氢火焰离子化检测器检测，以保留时间定性，外标法定量其中丙酸的含量。样品中的丙酸钠和丙酸钙以丙酸计，需要时，可根据相应参数分别计算丙酸钠和丙酸钙的含量。

2.试剂和溶液

①硅油。

②磷酸溶液（10+90）：取10mL磷酸加水至100mL。

③甲酸溶液（2+98）：取1mL甲酸加水至50mL。

④丙酸标准储备液（10mg/mL）：精确称取250.0mg丙酸标准品（纯度≥970%）于25mL容量瓶中，加水至刻度，4℃冰箱中保存，有效期为6个月。

⑤丙酸标准使用液：将贮备液用水稀释成10～250μg/mL的标准系列，临用现配。

3.仪器和设备

①气相色谱仪：带氢火焰离子化检测器。

②天平：感量为0.0001g和0.01g。

③水蒸气蒸馏装置、鼓风干燥箱。

4.测定步骤

（1）样品处理 样品均质后，准确称取25g（面包样品需用鼓风干燥箱在37℃下通风干燥2～3h，之后置于研钵中磨碎），置于500mL蒸馏瓶中，加入100mL水，再用50mL水冲洗容器，转移到蒸馏瓶中，加10mL磷酸溶液，2～3滴硅油，进行水蒸气蒸馏，蒸馏速度为2～3滴/s，将250mL容量瓶置于冰浴中作为吸收液装置，待蒸馏近250mL时取出，在室温下放置30min，加水至刻度。混匀，供气相色谱分析用。

（2）色谱参考条件

①色谱柱：聚乙二醇（PEG）石英毛细管柱，柱长30m，内径0.25mm，膜厚度0.5μm或同等性能色谱柱。

②载气：氮气，纯度＞99.99%；载气流速：1mL/min。

③进样口温度：250℃；分流比：10∶1；检测器温度：250℃；柱温箱温度：125℃保持5min，然后以15℃/min的速率升到180℃，保持3min；进样量：1μL。

（3）标准曲线的制作 取标准系列中各种浓度的标准使用液10mL，加0.5mL甲酸溶液混匀。将其分别注入气相色谱仪中，测定相应的峰面积或峰高，以标准工作液的浓度为横坐标，响应值（峰面积或峰高）为纵坐标，绘制标准曲线。

（4）样品测定 吸取10mL制备的样品溶液于试管中，加入0.5mL甲酸溶液，混匀，同标准系列同样进机测试。根据标准曲线计算样品中的丙酸浓度。

5.结果计算

式中 X——样品中丙酸钠（钙）含量（以丙酸计），g/kg；

ρ——由标准曲线得出的样液中丙酸的浓度，μg/mL；

m——样品质量，g；

V——样液最终定容体积，mL；

1000——μg/g换算至g/kg的系数。

样品中测得的丙酸含量乘以换算系数1.2967，即得丙酸钠的含量；样品中测得的丙酸含量乘以换算系数1.2569，即得丙酸钙含量。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。