护色剂含量测定方法详解

食品护色剂又称发色剂、呈色剂，是指能与肉及肉制品中呈色物质作用，使之在食品加工、储藏等过程中不致分解、破坏，呈现良好色泽的物质。在食品的加工过程中使用护色剂，能够较好的改善食品的感官性状及提高其商品性能。

护色剂一般泛指硝酸盐和亚硝酸盐类物质，它们本身并无着色能力，但当其应用于动物类食品后，腌制过程中其产生的一氧化氮能使肌红蛋白或血红蛋白形成亚硝基肌红蛋白或亚硝基血红蛋白，从而使肉制品保持稳定的鲜红色。在国家食品安全标准GB 5009.33-2016中规定了三种测定食品中亚硝酸盐与硝酸盐的方法，分别为离子色谱法、分光光度法和紫外分光光度法。紫外分光光度法主要用于蔬菜、水果中硝酸盐的测定。

（一）测定原理

试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，采用相应的方法提取和净化，以氢氧化钾溶液为淋洗液，阴离子交换柱分离，电导检测器或紫外检测器检测。以保留时间定性，外标法定量。

（二）试剂和溶液

1.试剂

（1）乙酸（CH₃COOH），氢氧化钾（KOH）。

（2）乙酸溶液（3%）量取乙酸3mL于100mL容量瓶中，以水稀释至刻度，混匀。

（3）氢氧化钾溶液（1mol/L）称取6g氢氧化钾，加入新煮沸过的冷水溶解，并稀释至100mL，混匀。

（4）亚硝酸盐标准储备液（100mg/L，以计，下同）准确称取0.1500g于110～120℃干燥至恒重的亚硝酸钠标准品，用水溶解并转移至1000mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

（5）硝酸盐标准储备液（1000mg/L，以计，下同）准确称取1.3710g于110～120℃干燥至恒重的硝酸钠标准品，用水溶解并转移至1000mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

（6）亚硝酸盐和硝酸盐混合标准中间液 准确移取亚硝酸根离子和硝酸根离子的标准储备液各1.0mL于100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，此溶液每升含亚硝酸根离子1.0mg和硝酸根离子10.0mg。

（7）亚硝酸盐和硝酸盐混合标准使用液 移取亚硝酸盐和硝酸盐混合标准中间液，加水逐级稀释，制成系列混合标准使用液，亚硝酸根离子浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20mg/L；硝酸根离子浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0mg/L。

2.仪器和设备

（1）离子色谱仪 配电导检测器及抑制器或紫外检测器，高容量阴离子交换柱，50μL定量环。

（2）食物粉碎机。

（3）超声波清洗器。

（4）分析天平 感量为0.1mg和1mg。

（5）离心机 转速≥10000r/min，配50mL离心管。

（6）22μm水性滤膜针头滤器。

（7）净化柱 包括C₁₈柱、Ag柱和Na柱或等效柱。

（8）注射器1.0mL和2.5mL。

所有玻璃器皿使用前均需依次用2mol/L氢氧化钾和水分别浸泡4h，然后用水冲洗3～5次，晾干备用。

（三）测定步骤

1.取样及预处理

（1）蔬菜、水果 将新鲜蔬菜、水果试样用自来水洗净后，用水（GB/T 6682）冲洗，晾干后，取可食部位切碎混匀。将切碎的样品用四分法取适量，用食物粉碎机制成匀浆，备用。如需加水应记录加水量。

（2）粮食及其他植物样品 除去可见杂质后，取有代表性试样50～100g，粉碎后过0.30mm孔筛，混匀备用。

（3）肉类、蛋、水产及其制品 用四分法取适量或取全部，用食物粉碎机制成匀浆，备用。

（4）乳粉、豆奶粉、婴儿配方粉等固态乳制品（不包括干酪）将试样装入能够容纳2倍试样体积的带盖容器中，通过反复摇晃和颠倒容器使样品充分混匀直到使试样均一化。

（5）发酵乳、乳、炼乳及其他液体乳制品 通过搅拌或反复摇晃和颠倒容器使试样充分混匀。

（6）干酪 取适量的样品研磨成均匀的泥浆状。为避免水分损失，研磨过程中应避免产生过多的热量。

2.提取

（1）蔬菜、水果等植物性试样 称取试样5g（精确至0.001g，可适当调整试样的取样量，以下相同），置于150mL具塞锥形瓶中，加入80mL水，1mL 1mol/L氢氧化钾溶液，超声提取30min，每隔5min振摇1次，保持固相完全分散。于75℃水浴中放置5min，取出放置至室温，定量转移至100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。溶液经滤纸过滤后，取部分溶液于10000r/min离心15min，上清液备用。

（2）肉类、蛋类、鱼类及其制品等 称取试样匀浆5g（精确至0.001g），置于150mL具塞锥形瓶中，加入80mL水，超声提取30min，每隔5min振摇1次，保持固相完全分散。于75℃水浴中放置5min，取出放置至室温，定量转移至100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。溶液经滤纸过滤后，取部分溶液于10000r/min离心15min，上清液备用。

（3）腌鱼类、腌肉类及其他腌制品 称取试样匀浆2g（精确至0.001g），置于150mL具塞锥形瓶中，加入80mL水，超声提取30min，每隔5min振摇1次，保持固相完全分散。于75℃水浴中放置5min，取出放置至室温，定量转移至100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。溶液经滤纸过滤后，取部分溶液于10000r/min离心15min，上清液备用。

（4）乳 称取试样10g（精确至0.01g），置于100mL具塞锥形瓶中，加水80mL，摇匀，超声30min，加入3%乙酸溶液2mL，于4℃放置20min，取出放置至室温，加水稀释至刻度。溶液经滤纸过滤，滤液备用。

（5）乳粉及干酪 称取试样2.5g（精确至0.01g），置于150mL具塞锥形瓶中，加水80mL，摇匀，超声30min，取出放置至室温，定量转移至100mL容量瓶中，加入3%乙酸溶液2mL，加水稀释至刻度，混匀。于4℃放置20min，取出放置至室温，溶液经滤纸过滤，滤液备用。

取上述备用溶液约15mL，通过0.22μm水性滤膜针头滤器、C₁₈柱，弃去前面3mL（如果氯离子浓度大于100mg/L，则需要依次通过针头滤器、C₁₈柱、Ag柱和Na柱，弃去前面的7mL），收集后面洗脱液待测。

固相萃取柱使用前需进行活化，C₁₈柱（1.0mL）、Ag柱（1.0mL）和Na柱（1.0mL），其活化过程为：C₁₈柱（1.0mL）使用前依次用10mL甲醇、15mL水通过，静置活化30min。Ag柱（1.0mL）和Na柱（1.0mL）用10mL水通过，静置活化30min。

3.色谱参考条件

（1）色谱柱 氢氧化物选择性，可兼容梯度洗脱的二乙烯基苯－乙基苯乙烯共聚物基质，烷醇基季铵盐功能团的高容量阴离子交换柱，4mm×250mm（带保护柱4mm×50mm），或性能相当的离子色谱柱。

（2）淋洗液 氢氧化钾溶液，浓度为6～70mmol/L，洗脱梯度为6mmol/L 30min，70mmol/L 5min，6mmol/L 5min，流速1.0mL/min。

若样品为粉状婴幼儿配方食品：氢氧化钾溶液，浓度为5～50mmol/L，洗脱梯度为5mmol/L 33min，50mmol/L 5min，5mmol/L 5min，流速1.3mL/min。

（3）抑制器 连续自动再生膜阴离子抑制器或等效抑制装置。

（4）检测器 电导检测器，检测池温度为35℃；或紫外检测器，检测波长为226nm。

（5）进样体积50μL（可根据试样中被测离子含量进行调整）。

4.标准曲线制作

将标准系列工作液分别注入离子色谱仪中，得到各浓度标准工作液色谱图，测定相应的峰高（μS）或峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰高（μS）或峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

5.试样溶液测定

将空白和试样溶液注入离子色谱仪中，得到空白和试样溶液的峰高（μS）或峰面积，根据标准曲线得到待测液中亚硝酸根离子或硝酸根离子的浓度。

（四）结果计算

式中 X——试样中亚硝酸根离子或硝酸根离子的含量，mg/kg；

ρ——测定用试样溶液中的亚硝酸根离子或硝酸根离子浓度，mg/L；

ρ₀——试剂空白液中亚硝酸根离子或硝酸根离子的浓度，mg/；

V——试样溶液体积，mL；

f——试样溶液稀释倍数；

1000——换算系数；

m——试样取样量，g。

试样中测得的亚硝酸根离子含量乘以换算系数1.5，即得亚硝酸盐（按亚硝酸钠计）含量；试样中测得的硝酸根离子含量乘以换算系数1.37，即得硝酸盐（按硝酸钠计）含量。

结果保留2位有效数字。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

此方法中亚硝酸盐和硝酸盐检出限分别为0.2mg/kg和0.4mg/kg。

亚硝酸盐采用盐酸萘乙二胺法测定，硝酸盐采用镉柱还原法测定。

（一）测定原理

样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，外标法测得亚硝酸盐含量。采用镉柱将硝酸盐还原成亚硝酸盐，测得亚硝酸盐总量，由测得的亚硝酸盐总量减去试样中亚硝酸盐含量，即得试样中硝酸盐含量。

（二）试剂和仪器

1.试剂

（1）亚铁氰化钾溶液（106g/L）称取106.0g亚铁氰化钾［K₄Fe（CN）₆·3H₂O］，用水溶解并稀释至1000mL。

（2）乙酸锌溶液（220g/L）称取220.0g乙酸锌［Zn（CH₃COO）₂·2H₂O］，加30mL冰乙酸溶于水并稀释至1000mL。

（3）饱和硼砂溶液（50g/L）称取50g硼酸钠（Na₂B₄O₇·10H₂O），溶于100mL热水中，冷却后备用。

（4）氨缓冲溶液（pH9.6～9.7）量取30mL盐酸，100mL水，混匀后加65mL氨水，再加水稀释至1000mL，混匀。

（5）氨缓冲液的稀释液 量取50mL pH9.6～9.7氨缓冲溶液，加水稀释至500mL，混匀。

（6）盐酸（0.1mol/L）量取8.3mL盐酸，用水稀释至1000mL。

（7）盐酸（2mol/L）量取167mL盐酸，用水稀释至1000mL。

（8）盐酸溶液（20%）量取20mL盐酸，用水稀释至100mL。

（9）对氨基苯磺酸溶液（4g/L）称取0.4g对氨基苯磺酸，溶于100mL 20%盐酸中，混匀，置棕色瓶中，避光保存。

（10）盐酸萘乙二胺溶液（2g/L）称取0.2g盐酸萘乙二胺，溶解于100mL水中，混匀后，置棕色瓶中，避光保存。

（11）硫酸铜溶液（20g/L）称取20g硫酸铜，加水溶解，并稀释至1000mL。

（12）硫酸镉溶液（40g/L）称取40g硫酸镉，加水溶解，并稀释至1000mL。(www.xing528.com)

（13）乙酸溶液（3%）量取冰乙酸3mL于100mL容量瓶中，以水稀释至刻度，混匀。

（14）亚硝酸钠标准溶液（200μg/mL，以亚硝酸钠计）准确称取0.1000g于110～120℃干燥恒重的亚硝酸钠标准品，加水溶解移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

（15）硝酸钠标准溶液（200μg/mL，以亚硝酸钠计）准确称取0.1232g于110～120℃干燥恒重的硝酸钠标准品，加水溶解，移于500mL容量瓶中，并稀释至刻度。

（16）亚硝酸钠标准使用液（5.0μg/mL）临用前，吸取2.50mL亚硝酸钠标准溶液，置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度。

（17）硝酸钠标准使用液（5.0μg/mL）临用前，吸取2.50mL硝酸钠标准溶液，置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度。

2.仪器

（1）天平 感量为0.1mg和1mg。

（2）组织捣碎机、超声波清洗器、恒温干燥箱、分光光度计、镉柱或镀铜镉柱。

①海绵状镉的制备：镉粒直径0.3～0.8mm。将适量的锌棒放入烧杯中，用40g/L硫酸镉溶液浸没锌棒。在24h之内，不断将锌棒上的海绵状镉轻轻刮下。取出残余锌棒，使镉沉底，倾去上层溶液。用水冲洗海绵状镉2～3次后，将镉转移至搅拌器中，加400mL盐酸（0.1mol/L），搅拌数秒，以得到所需粒径的镉颗粒。将制得的海绵状镉倒回烧杯中，静置3～4h，期间搅拌数次，以除去气泡。倾去海绵状镉中的溶液，并可按下述方法进行镉粒镀铜。

②镉粒镀铜：将制得的镉粒置锥形瓶中（所用镉粒的量以达到要求的镉柱高度为准），加足量的盐酸（2mol/L）浸没镉粒，振荡5min，静置分层，倾去上层溶液，用水多次冲洗镉粒。在镉粒中加入20g/L硫酸铜溶液（每克镉粒约需2.5mL），振荡1min，静置分层，倾去上层溶液后，立即用水冲洗镀铜镉粒（注意镉粒要始终用水浸没），直至冲洗的水中不再有铜沉淀。

③镉柱的装填：如图3-1所示，用水装满镉柱玻璃柱，并装入约2cm高的玻璃棉做垫，将玻璃棉压向柱底时，应将其中所包含的空气全部排出，在轻轻敲击下，加入海绵状镉至8～10cm［装置（1）］或15～20cm［装置（2）］，上面用1cm高的玻璃棉覆盖。若使用装置（2），应在上置一贮液漏斗，末端要穿过橡皮塞与镉柱玻璃管紧密连接。如无镉柱玻璃管时，可以用25mL酸式滴定管代替，但过柱时要注意始终保持液面在镉层之上。

镉柱填装好后，先用0.1mol/L盐酸25mL洗涤，再以水洗2次，每次25mL。镉柱每次使用完毕后，应先以25mL盐酸（0.1mol/L）洗涤，再以水洗2次，每次25mL，最后用水覆盖镉柱。镉柱不用时用水封盖，随时都要保持水平面在镉层之上，不得使镉层夹有气泡。

图3-1 镉柱的装填示意图

1—贮液漏斗，内径35mm，外径37mm 2—进液毛细管，内径0.4mm，外径6mm 3—橡皮塞4—镉柱玻璃管，内径12mm，外径16mm 5、7—玻璃棉6—海绵状镉8—出液毛细管，内径2mm，外径8mm

④镉柱还原效率的测定：吸取20mL硝酸钠标准使用液，加入5mL氨缓冲液稀释液，混匀后注入贮液漏斗，使其流经镉柱还原，用100mL容量瓶收集洗提液。洗提液的流量不应超过6mL/min，在贮液杯将要排空时，用约15mL水冲洗杯壁。冲洗水流尽后，再用15mL水重复冲洗，第2次冲洗水流尽后，将贮液杯灌满水，并使其以最大流量流过柱子。当容量瓶中的洗提液接近100mL时，从柱子下取出容量瓶，用水定容至刻度，混匀。

取10.0mL还原后的溶液（相当10μg亚硝酸钠）于50mL比色管中，吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、10.0、12.5μg亚硝酸钠），分别置于50mL带塞比色管中。上述各管中分别加入2mL 4g/L对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5min，各加入1mL 2g/L盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用1cm比色杯，零管调零，在波长538nm处测吸光度，绘制标准曲线。根据标准曲线计算测得结果，与加入量一致，还原效率应大于95%为符合要求。还原效率的计算：

式中 X——还原效率，%；

m₁——测得亚硝酸钠的含量，μg；

10——测定用溶液相当于亚硝酸钠的含量，μg。

如果还原率小于95%时，将镉柱中的镉粒倒入锥形瓶中，加入足量的盐酸（2moL/L）中，振荡数分钟，再用水反复冲洗。

（三）测定步骤

（1）取样及预处理 同离子色谱法。

（2）提取

①干酪：称取试样2.5g（精确至0.001g），置于150mL具塞锥形瓶中，加水80mL，摇匀，超声30min，取出放置至室温，定量转移至100mL容量瓶中，加入3%乙酸溶液2mL，加水稀释至刻度，混匀。于4℃放置20min，取出放置至室温，溶液经滤纸过滤，滤液备用。

②液体乳样品：称取试样90g（精确至0.001g），置于250mL具塞锥形瓶中，加12.5mL饱和硼砂溶液，加入70℃左右的水约60mL，混匀，沸水浴中加热15min，取出置冷水浴中冷却至室温。定量转移上述提取液至200mL容量瓶中，加入5mL106g/L亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL 220g/L乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置30min，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，滤液备用。

③乳粉：称取试样10g（精确至0.001g），置于150mL具塞锥形瓶中，加12.5mL 50g/L饱和硼砂溶液，加入70℃左右的水约150mL，混匀，以下操作同②。

④其他样品：称取5g（精确至0.001g）匀浆试样（如制备过程中加水，应按加水量折算），置于250mL具塞锥形瓶中，加12.5mL 50g/L饱和硼砂溶液，加入70℃左右的水约150mL，混匀，以下操作同②。

（3）亚硝酸盐的测定 吸取40.0mL上述滤液于50mL带塞比色管中，另吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、10.0、12.5μg亚硝酸钠），分别置于50mL带塞比色管中。于标准管与试样管中分别加入2mL 4g/L对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5min后各加入1mL 2g/L盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用1cm比色杯，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度，绘制标准曲线，同时做试剂空白。结果计算：

式中 X₁——试样中亚硝酸钠的含量，mg/kg；

m₂——测定用样液中亚硝酸钠的质量，μg；

1000——转换系数；

m₃——试样质量，g；

V₁——测定用样液体积，mL；

V₀——试样处理液总体积，mL。

结果保留2位有效数字，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

（4）硝酸盐的测定

①镉柱还原：先以25mL氨缓冲液的稀释液冲洗镉柱，流速控制在3～5mL/min（以滴定管代替的可控制在2～3mL/min）。

吸取20mL滤液于50mL烧杯中，加5mL pH9.6～9.7氨缓冲溶液，混合后注入贮液漏斗，使其流经镉柱还原，当贮液杯中的样液流尽后，加15mL水冲洗烧杯，再倒入贮液杯中。冲洗水流完后再用15mL水重复1次。当第2次冲洗水快流尽时，将贮液杯装满水，以最大流速过柱。当容量瓶中的洗提液接近100mL时，取出容量瓶，用水定容刻度，混匀。

②亚硝酸钠总量的测定：吸取10～20mL还原后的样液于50mL比色管中。以下同上述亚硝酸盐测定。硝酸盐（以硝酸钠计）含量计算：

式中 X₂——试样中硝酸钠的含量，mg/kg；

m₄——经镉粉还原后测得总亚硝酸钠的质量，μg；

1000——转换系数；

m₅——试样的质量，g；

V₂——测总亚硝酸钠的测定用样液体积，mL；

V₃——试样处理液总体积，mL；

V₅——经镉柱还原后样液的测定用体积，mL；

V₄——经镉柱还原后样液总体积，mL；

X₁——试样中亚硝酸钠的含量，mg/kg；

1.232——亚硝酸钠换算成硝酸钠的系数。

结果保留2位有效数字，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

（一）测定原理

用pH9.6～9.7的氨缓冲液提取样品中硝酸根离子，同时加活性炭去除色素类物质，加沉淀剂去除蛋白质及其他干扰物质，利用硝酸根离子和亚硝酸根离子在紫外区219nm处具有吸收波长的特性，测定提取液的吸光度。其测得结果为硝酸盐和亚硝酸盐吸光度的总和，鉴于新鲜蔬菜、水果中亚硝酸盐含量甚微，可忽略不计。测定结果为硝酸盐的吸光度，可从工作曲线上查得相应的质量浓度，计算样品中硝酸盐的含量。

（二）试剂和溶液

1.试剂

（1）盐酸（HCl，密度1.19g/mL），氨水（NH₃·H₂O，25%），正辛醇（C₈H₁₈O），活性炭（粉状）。

（2）氨缓冲溶液（pH9.6～9.7）量取20mL盐酸，加入到500mL水中，混合后加入50mL氨水，用水定容至1000mL，调pH至9.6～9.7。

（3）亚铁氰化钾溶液（150g/L）称取150g亚铁氰化钾溶于水，定容至1000mL。

（4）硫酸锌溶液（300g/L）称取300g硫酸锌溶于水，定容至1000mL。

（5）硝酸钾标准储备液液（500mg/L，以硝酸根计）称取0.2039g于110～120℃干燥至恒重的硝酸钾标准品，用水溶解并转移至250mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。于冰箱内保存。

（6）硝酸盐标准曲线工作液 分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mL硝酸盐标准储备液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀。此标准系列溶液硝酸根质量浓度分别为0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0mg/L。

2.仪器

紫外分光光度计；分析天平：感量0.01g和0.0001g；组织捣碎机；可调式往返振荡机；pH计：精度为0.01。

（三）测定步骤

1.取样及预处理

选取一定数量有代表性的样品，先用自来水冲洗，再用水（GB/T 6682）清洗干净，晾干表面水分，用四分法取样，切碎，充分混匀，于组织捣碎机中匀浆（部分少汁样品可按一定质量比例加入等量水），在匀浆中加1滴正辛醇消除泡沫。

2.提取

称取10g（精确至0.01g）匀浆试样（如制备过程中加水，应按加水量折算）于250mL锥形瓶中，加水100mL，加入5mL氨缓冲溶液（pH9.6～9.7），2g粉末状活性炭。振荡（往复速度为200次/min）30min。定量转移至250mL容量瓶中，加入2mL 150g/L亚铁氰化钾溶液和2mL 300g/L硫酸锌溶液，充分混匀，加水定容至刻度，摇匀，放置5min，上清液用定量滤纸过滤，滤液备用。同时做空白。

3.测定

根据试样中硝酸盐含量的高低，吸取上述滤液2～10mL于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀。用1cm石英比色皿，于219nm处测定吸光度。按公式计算硝酸盐（以硝酸根计）含量：

式中 X——试样中硝酸盐的含量，mg/kg；

ρ——由工作曲线获得的试样溶液中硝酸盐的质量浓度，mg/L；

V₆——提取液定容体积，mL；

V₈——待测液定容体积，mL；

m₆——试样的质量，g；

V₇——吸取的滤液体积，mL。

结果保留2位有效数字，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。