脂肪检测技术：碱性乙醚抽取法简介

脂类化合物是食品三大营养物质之一，95%是脂肪（甘油三酯、中性脂），5%是其他脂类，如磷脂、糖脂、固醇等。食品中脂肪除提供人体必需的能量和某些脂肪酸外，它可为食品提供滑润的口感，光洁的外观，赋予加工食品特殊的风味。本节主要介绍脂肪总量及组成的检测技术。

（一）索氏抽提法

1.原理

经干燥后的样品使用索氏脂肪抽提装置，在一定温度下以有机溶剂提取样品中的脂肪后，蒸去溶剂，所得的物质即为脂肪。

2.仪器

索氏脂肪抽提器。

3.试剂

无水乙醚，无水硫酸钠，硫酸铜及氢氧化钠溶液。

4.操作方法

（1）样品处理 准确称取肉、蛋和鱼粉样品5.00～8.00g，装入滤纸筒中；谷、豆类样品磨碎成粉末，经100～105℃烘干2～3h后，准确称取5.00～10.00g，装滤纸筒中；称取糖果和果酱等样品5.00～10.00g，置于烧杯中，分别加入水200mL，搅拌中加入10mL硫酸铜溶液（69.3g/L），充分搅匀后加入氢氧化钠溶液（10.2g/L）调节pH至呈微酸性，充分搅和后静置，过滤除去糖分，将残留物及滤纸一起烘干装入滤纸筒中。

（2）样品测定 滤纸筒上层覆盖脱脂棉后放在索氏抽提器的抽提管内，把抽提管与已知重量的干燥脂肪烧瓶连接并接在冷凝器上，由抽提器冷凝管上端加入乙醚约100mL，通入冷凝水，在70℃左右水浴上加热6～8h，最好控制每小时虹吸20次。取出滤纸筒，利用抽提器回收乙醚。将烧瓶取下揩干，在100～105℃烘箱中烘干1～2h，直至前后两次重量差不超过0.001g为止。

5.结果计算

式中 m₁——乙醚抽出物质量，g；

m₂——样品的质量，g。

6.说明

（1）本法是经典方法，也是GB 5009.6-2016食品安全国家标准。由于食品种类不同，提取脂肪的时间也不同，因此根据不同食品中脂肪含量掌握加热提取时间。检查样品中脂肪是否提取完全，可以用滤纸条将抽提管内氯仿滴在滤纸上，待乙醚挥发后观察滤纸上有无油迹，如无油迹存在，说明提取完全。

（2）抽取试剂要按检验方法所规定的要求选择。一般使用甲醇或氯仿－甲醇提取脂肪，比单独用氯仿提取脂肪，其含量高一些。原因是样品中（如鱼粉）含有的脂蛋白和磷酯类的脂肪完全被抽提出来。

（二）碱性乙醚抽取法

本法是乳品脂肪测定公认的标准法。适用于能在碱性溶液中溶解或至少能形成均匀混悬胶体的样品，除牛乳、奶油外，也适用于溶解度良好的乳粉。至于已结块的乳粉，用本法测定时，其结果往往偏低。

1.原理

乙醚不能从牛乳或其他液体食品中直接抽取脂肪。需先用碱处理，使酪蛋白钙盐溶解，并降低其吸附力，才能使脂肪球与乙醚混合。在乙醇和石油醚存在下，使乙醇溶解物留存在溶液内，加入石油醚则可使乙醚不与水混溶，而只抽出脂肪和类脂化合物。石油醚的存在可使分层清晰。将醚层分离并将醚除去后，即可得出脂肪含量。

2.试剂

氢氧化铵，96%乙醇，乙醚，石油醚（馏程30～60℃）。

3.操作方法

称取样品1.00～5.00g，置于小烧杯中，加水至10mL，再加氢氧化铵10mL，用玻璃棒搅拌成匀乳状，倒入100mL具塞量筒中（若为液体样品如牛乳，可直接吸取10mL于量筒中，加氢氧化铵1.25mL，以下见鲜乳中有关脂肪的测定）。用10mL乙醇分数次洗涤烧杯，洗液并入量筒中，加塞振摇。再以25mL乙醚洗涤烧杯，并入量筒中，加塞振荡1min。再用25mL石油醚洗涤烧杯，并入量筒中，加塞振荡1min。静置约30min，待分层清晰后，装上吹管，将上层醚层吹出，经干燥滤纸滤入已知重量的脂肪瓶中。再加乙醚－石油醚（1∶1）混合液10mL于量筒中，不经振荡，静置5min，再将醚层吹出，滤入上述脂肪层中。再加乙醇2mL、乙醚15mL于量筒中，振摇0.5min，再加石油醚15mL（或混合醚30mL），静置，待分层清晰后，吹出，滤至同一脂肪瓶中。重复上述操作1次，将脂肪瓶内混合醚在水浴上蒸馏回收，所得脂肪在100～106℃烘箱中烘2h，冷却称重。

4.结果计算

按下式计算脂肪含量：

式中 m₁——剩余物的质量，g；

m₂——样品的质量，g。

（三）酸性乙醚提取法

1.原理

食品样品经盐酸水解后，用乙醚提取脂肪，然后在沸水浴中回收和除去溶剂，称重而获得游离和结合的脂肪含量。

2.试剂

盐酸，乙醇，乙醚，石油醚。

3.仪器

索氏抽脂瓶或锥形瓶。

4.操作方法

①准确称取固体样品2.00g，移入50mL大试管中，加入蒸馏水8mL，混匀后再加入盐酸10mL（液体样品称取10.00g，加入盐酸10mL于大试管中）。将试管移入70～80℃水浴中加热，每隔5～10min摇动一次至全部样品完全消化为止。时间约40～50min。

②取出试管，冷却，加入乙醇10mL，然后将全部样液移入125mL分液漏斗中，以25mL乙醚分次洗涤试管。将乙醚移入分液漏斗中，加塞，振摇1min。振摇时不断地放出气体，以免样液溅出。静置15min，并用等量的石油醚－乙醚混合试剂冲洗瓶塞及分液漏斗瓶口，以使附着的脂肪洗涤于瓶内。静置10～20min，待上层有机层清晰，把下层水层放入小烧杯后，将乙醚等试剂层放至已恒重的锥形瓶中，再将水层移入分液漏斗中，再加入5mL乙醚，如此反复提取两次，将乙醚收集于恒重锥形瓶中，利用索氏抽脂装置或其他冷凝装置回收乙醚及石油醚，将锥形瓶置于沸水浴中完全蒸干。置于100～105℃干燥2h，取出放入干燥器内冷却30min后称重。

5.计算

式中 m₁——锥形瓶及脂肪重量，g；

m₂——锥形瓶质量，g；

m——样品质量，g。

6.说明

本法适用于结块和不溶性固体样品中脂肪含量的测定。

在油脂脂肪酸组成分析中，使用最普及的分析法有气相谱法、高效液相色谱法、红外光谱法、质谱法以及联机（气相色谱－红外光谱，气相色谱－质谱）法。红外光谱及质谱起着鉴定器的作用，如红外吸收光谱可以方便地鉴定官能团，在质谱中采用大气压化学离子源（APCI）可以方便地用于极性、难挥发性化合物的离子化，通过电喷雾电离、APCI谱图可获得平均相对分子质量及相对分子质量分布信息。通过这些仪器的分离鉴定，不仅对油脂、脂肪酸及其衍生物能进行定性定量分析，而且可以对其分子结构，相对分子质量或官能团等进行鉴别。本文仅就广泛使用的气相色谱法进行扼要叙述。

1.实验原理

本实验采用气相色谱法对食品中脂肪酸组成进行分析，其测定原理为将试样所含油脂进行皂化，脂肪酸经甲酯化后，用石油醚或正己烷提取。在一定的条件下利用样品中各组分在色谱柱中流动相和固定相的分配系数不同来达到样品的分离。与标准品进行比较，以保留时间进行定性，峰面积进行定量。

2.试剂

1mol/L KOH－甲醇溶液：取氢氧化钾56g，用甲醇溶解，定容至1000mL。

1mol/L HCl－甲醇溶液：甲醇溶液500mL，称重。将分析纯HCl溶液滴加到氯化钙中产生气体HCl，通入500mL甲醇溶液中，一定时间后再称重，直到原甲醇溶液增加了36.5g即可。

正己烷或石油醚。

3.仪器设备

冷冻干燥机、恒温水浴锅、电子天平，气相色谱仪GC（HP 6890）。

4.检测步骤

（1）样品处理 将适量样品进行冷冻干燥，在研钵中充分磨细（也可取鲜样直接匀浆）。称取干燥样品50mg左右（根据脂肪含量而定）于带螺盖10mL刻度试管中。加1mol/L KOH－甲醇溶液4mL，旋紧管盖，在75～80℃水浴中保温15min，取出，待冷却后加1mol/L HCl甲醇溶液4mL，继续在75～80℃水浴中保温15min，取出，冷却后加正己烷（或石油醚）1mL充分振荡萃取1min。静止分层（需要时稍加水有利于分层），使脂肪酸甲酯溶于正己烷层。

（2）测定 用微量进样器取上清液1μL，上机进样，进行气相色谱分析。采用氢火焰离子化检测器（FID），色谱柱为毛细管柱（内径0.25mm，膜厚0.25μm，长30m，最高温度300℃）。

（3）分析条件 采取程序升温，柱温：150℃保留1min，经15℃/min升至200℃，再经2℃/min升至250℃。汽化室温度为250℃，检测器温度为250℃。氮气压力0.4MPa，氢气压力0.2～0.3MPa，空气压力0.4MPa。

5.数据处理

（1）定性分析 比较未知峰与同样条件下测得的脂肪酸标样的保留时间，对脂肪酸进行定性分析。

（2）定量分析 组分的含量与峰面积成正比，根据面积归一法求出脂肪酸的相对含量。

6.注意事项(www.xing528.com)

（1）待测样品不宜加热干燥，否则脂肪酸易被氧化。

（2）进行脂肪酸皂化和甲酯化时，应注意温度和时间的控制。

1.为什么国家标准中水分含量的直接测定法（GB 5009.3-2016）不适用于水分含量小于0.5g/100g的样品？

2.为什么在测定维生素E时，有的食品可不经过皂化，就可直接提取？

3.水分活度国家标准测定方法（GB 5009.238-2016）为什么不适用于冷冻和含挥发性成分的食品？

4.测维生素B₂（核黄素）加NaOH时，为什么要边摇边加？

5.用高效液相色谱法能同时测定多种维生素含量吗？

1.采用气相色谱法分析食品中脂肪酸组成，其原理是（　）

A.先要皂化，然后用石油醚或正己烷提取，用GC测定。

B.先要皂化、甲酯化后，用石油醚或正己烷提取，用LC测定。

C.先要皂化、甲酯化后，用石油醚或正己烷提取。用GC测定。

D.脂肪酸经甲酯化后，用石油醚或正己烷提取，用GC测定。

2.乳品中脂肪测定的公认标准法是（　）。

A.碱性乙醚抽取法

B.酸性乙醚提取法

C.索氏抽提法

D.皂化后石油醚法

3.在测定膳食纤维含量时，有的试样要用85%乙醇溶液多次清洗，其清洗目的是（　）。

A.脱醇溶物，如脂类、添加剂

B.沉淀多糖，减少干扰

C.脱醇溶物，如单糖、双糖等

D.脱色素、单糖、添加剂

4.测定新鲜样品中果胶含量时，要注意（　）。

A.浸入乙醇中以钝化酶的活性

B.除去可溶性糖和脂类物质

C.要用高温钝化酶的活性

D.要先用乙醇沉淀分离出果胶

5.在测定硒时要用到2，3－二氨基萘，操作时要注意，因为它（　）。

A.有毒，有致癌性

B.有刺激性

C.有腐蚀性

D.易挥发、易燃

6.氮换算为蛋白质的系数一般食物为6.25。但某些食品要少于6.25，如芝麻、花生、大米、大豆分别是（　）。

A.5.30、5.46、5.95和5.71

B.5.30、5.46、5.25和5.71

C.5.95、5.46、5.30和5.71

D.6.05、6.16、5.30和5.71

7.凯氏定氮法时，若样品中含脂肪较多，消化过程中易产生大量泡沫。此时，在样品中加入（　），并同时注意控制热源强度。

A.少量石油和丙醇

B.少量辛醇或硅油消泡剂

C.少量辛醇或液体石蜡

D.少量液体石蜡或硅油消泡剂

8.蔗糖是由葡萄糖和果糖组成的双糖，（　）直接测定。

A.具有还原性，不能用碱性铜盐试剂

B.不具有还原性，不能用碱性铜盐试剂

C.不具有还原性，能用碱性铜盐试剂

D.具有还原性，能用碱性铜盐试剂

9.测定试样中硒含量时，样品先要在盐酸介质中将（　），由载气带入检测仪器测定。

A.二价硒氧化成四价硒

B.六价硒还原成四价硒

C.再将四价硒还原成负二价

D.再将四价硒氧化成六价硒

10.在进行凯氏定氮法测定蛋白质时，要向接收瓶内加入10.0mL硼酸溶液及1～2滴混合指示液（　）。

A.2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液，临用时混合

B.1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液，临用时混合

C.1份甲基红乙醇溶液与2份亚甲基蓝乙醇溶液，临用时混合

D.5份甲基红乙醇溶液与1份溴甲酚绿乙醇溶液，临用时混合

［1］张意静．食品分析技术［M］.北京：中国轻工业出版社，2001 .

［2］黄伟坤．食品成分分析手册［M］.北京：中国轻工业出版社，1998.

［3］王世平．食品理化检验技术［M］.北京：中国林业出版社，2009.

［4］刘绍．食品分析与检验［M］.武汉：华中科技大学出版社，2011 .