测定维生素A的标准曲线与计算直线回归方程方法

维生素是一类维持人体正常生理功能所必需的有机营养素，每种维生素履行着特殊的生理功能，缺乏时将引起相关的营养缺乏症。通常根据它们的溶解性质，将其分为脂溶性维生素（维生素A、维生素D、维生素E等）和水溶性维生素（B族维生素、维生素C等）两大类。

1.原理

样品皂化后，维生素A抽提至有机溶剂中，经浓缩后，C₃₀或PFP反相液相色谱柱分离，紫外检测器或荧光检测器检测，外标法定量。

2.试剂及设备

（1）试剂 无水乙醇、抗坏血酸、氢氧化钾、乙醚、石油醚、无水硫酸钠、pH试纸、甲醇、淀粉酶（活力单位≥100U/mg）和2，6－二叔丁基对甲苯酚（BHT）。

（2）维生素A标准品 视黄醇（纯度≥95%）。

（3）设备 高效液相色谱仪（带紫外检测器或二极管阵列检测器或荧光检测器）、磁力加热搅拌器、旋转蒸发器、恒温水浴振荡器、分析天平、分液漏斗、玻璃漏斗、容量瓶（100mL）、标准口三角瓶、移液管（1mL、10mL）、氮吹仪、定量滤纸。

3.检测步骤

（1）样品处理 取牛乳50mL（或蛋黄5g）于标准口三角瓶中，加乙醇60mL、50%KOH 2mL，接上冷凝管，于磁力搅拌器上加热30min，温度控制在50℃左右。取分液漏斗两个，固定于铁架台上，一个加50mL乙醚或乙烷做第一次提取用，另一个加30mL乙醚做第二次提取用。样品皂化完后，取下三角瓶并用蒸馏水将冷凝管口冲洗，洗液并入三角瓶内，冷却至室温后，慢慢倒入第一个分液漏斗中，并用蒸馏水洗三角瓶2～3次，振摇片刻后静止待分层。取下层液移入第二次提取液中，同上处理后弃去下层。将两次提取液合并，同时将另一漏斗用乙醚冲洗三次，然后用蒸馏水洗涤提取液，以除去KOH和乙醇，直至蒸馏水用pH试纸测试为中性。

在100mL棕色容量瓶中加0.2g BHT，瓶上放漏斗、滤纸及无水Na₂SO₄，将提取液通过无水Na₂SO₄脱水，用乙醚冲洗分液漏斗，最后定容至1000mL，摇匀待用。取10mL于鸡心瓶中，在50℃恒温水浴中旋转蒸发至干，取下后立即用1.0mL无水甲醇溶解，摇动后上机测定。

（2）色谱条件 色谱柱：C₃₀柱（柱长250mm，内径4.6mm，粒径3μm）；流动相：A：水；B：甲醇，洗脱梯度见表2-1；紫外检测波长：325nm；流速：0.8mL/min；进样量：10μL；柱温：20℃。

表2-1 C₃₀色谱柱—反相高效液相色谱法洗脱梯度参考条件

（3）标准曲线的制作 本法采用外标法定量。将维生素A标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以峰面积为纵坐标，以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线，计算直线回归方程。

（4）样品测定 试样液经高效液相色谱仪分析，测得峰面积，采用外标法通过上述标准曲线计算其浓度。在测定过程中，建议每测定10个样品用同一份标准溶液或标准物质检查仪器的稳定性。

4.结果计算

试样中维生素A的含量按下式计算：

式中 X——试样中维生素A的含量，μg/100g；

ρ——根据标准曲线计算得到的试样中维生素A的浓度，μg/mL；

V——定容体积，mL；

f——换算因子（维生素A：f=1；维生素E：f=0.001）；

100——试样中量以每100g计算的换算系数；

m——试样的称样量，g。

1.原理

将样品皂化，由酯型转化为游离型，用高效液相色谱测定。

2.试剂及设备

（1）试剂 乙醚（不含过氧化物）、乙醇、甲醇、无水Na₂SO₄、50%KOH溶液、焦性没食子酸。维生素D标准（Merck）液的配制：称取5.3mg标准品，用少量乙醇溶解后用甲醇定溶至50mL，即为106μg/mL的标准液，再取1.0mL定容至25mL，即为4.24μg/mL的高效液相色谱仪用的标准溶液。

（2）设备 高效液相色谱仪具可调波长紫外检测器，直型K－D浓缩器，磁力加热搅拌器。

3.检测步骤

（1）皂化 取5～10g样品，加1g焦性没食子酸50mL乙醇溶液，在磁力搅拌器下使样品均匀溶解后加入30mL 50%KOH溶液，在（50±2）℃搅拌回流40mim。

（2）提取 取下回流液，冲凉后用50、30、20、10mL乙醚萃取，合并乙醚层，用水洗至中性，过无水Na₂SO₄，在50℃下浓缩至约5mL，取下后，用甲醇定容至10mL，待测定。

（3）色谱条件 色谱柱：μ－Bondapak C₁₈3.9mm×30cm；流动相：甲醇；流速：0.8mL/min；测定波长：265nm。

（4）样品测定 吸取处理好的样品20μL，注入高效液相色谱仪，进行HPLC分析，同时进行标准溶液的分析，将样品的峰与标准溶液峰比较，以保留时间定性，峰高或峰面积定量。

4.结果计算

式中 S′——样品峰面积；

S——标准峰面积；

A——样品稀释总体积，mL；

ρ——标准溶液浓度，μg/mL。

1.原理

样品皂化后，维生素E由酯型转化为游离型，用高效液相色谱测定，但有时为节省时间也可省去皂化，直接提取后进行测定。

2.试剂及设备

（1）试剂50%KOH溶液，无水乙醇、乙醚（无过氧化物）、2，6－二叔丁基对甲苯酚（BHT）、异辛烷、1，4－二烷。维生素E标准溶液：精确称量一定量的标准维生素E，溶于异辛烷中，使最终浓度为20μg/mL。

（2）设备 植物捣碎机，旋转蒸发仪，磁力加热搅拌器，冷凝管，高效液相色谱仪（具可调波长紫外检测器）。

3.检测步骤

（1）样品处理 取样品于植物捣碎机中捣碎，准确称取5～10g于三角瓶中，加20mL 50% KOH，60mL无水乙醇，接上冷凝管，于磁力加热搅拌器上70℃回流30min，回流结束后，样品冷却至40℃左右后，用乙醚提取两次，用水洗至中性，经无水Na₂SO₄脱水后，提取液移入250mL容量瓶中，加入100mg抗氧化剂BHT，待BHT溶解后，定容至刻度，混匀，吸取100mL提取液于鸡心瓶中，在50℃水浴中旋转蒸发干燥，用2.0mL异辛烷溶解，贮于瓶中。

（2）色谱条件 色谱柱：Lichrosorb Si－60250mm×4mm；流动相：含0.4% 1，4－二烷的异辛烷；流速：1.0～1.5mL/min；检测器：紫外280nm；进样量：20μL。

（3）结果计算 根据标准维生素E的保留时间定性，根据样品的峰高或峰面积积分值定量。

4.注意事项

（1）若为蔬菜、水果等低脂肪样品，可不经过皂化，直接提取。

（2）若为植物油等样品，可稀释后过滤直接上机。

1.原理

硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外线下，噻嘧色素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其它荧光物质干扰时，此荧光强度与噻嘧色素量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。如试样中含杂质过多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离，然后以所得溶液用于测定。

2.试剂及设备

（1）试剂 正丁醇（CH₃CH₂CH₂CH₂OH），无水硫酸钠（Na₂SO₄）：560℃烘烤6h后使用，铁氰化钾［K₃Fe（CN）₆］，氢氧化钠（NaOH），盐酸（HCl），乙酸钠（CH₃COONa· 3H₂O），冰乙酸（CH₃COOH），人造沸石，硝酸银（AgNO₃），溴甲酚绿（C₂₁H₁₄Br₄O₅S），五氧化二磷（P₂O₅）或者氯化钙（CaCl₂），氯化钾（KCl），淀粉酶：不含维生素B₁，酶活力≥3700U/g，木瓜蛋白酶：不含维生素B₁，酶活力≥800U（活力单位）/mg。

（2）试剂配制0.1mol/L盐酸溶液：移取8.5mL盐酸，用水稀释并定容至1000mL，摇匀。

0.01mol/L盐酸溶液：量取0.1mol/L盐酸溶液50mL，用水稀释并定容至500mL，摇匀。

2mol/L乙酸钠溶液：称取272g乙酸钠，用水溶解并定容至1000mL，摇匀。

氯化钾溶液（250g/L）：称取250g氯化钾，用水溶解并定容至1000mL，摇匀。

酸性氯化钾（250g/L）：移取8.5mL盐酸，用250g/L氯化钾溶液稀释并定容至1000mL，摇匀。

氢氧化钠溶液（150g/L）：称取150g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000mL，摇匀。

铁氰化钾溶液（10g/L）：称取1g铁氰化钾，用水溶解并定容至100mL，摇匀，于棕色瓶内保存。

碱性铁氰化钾溶液：移取4mL 10g/L铁氰化钾溶液，用150g/L氢氧化钠溶液稀释至60mL，摇匀。用时现配，避光使用。

乙酸溶液：量取30mL冰乙酸，用水稀释并定容至1000mL，摇匀。

0.01mol/L硝酸银溶液：称取0.17g硝酸银，用100mL水溶解后，于棕色瓶中保存。

0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取0.4g氢氧化钠，用水溶解并定容至100mL，摇匀。

溴甲酚绿溶液（0.4g/L）：称取0.1g溴甲酚绿，置于小研钵中，加入1.4mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液研磨片刻，再加入少许水继续研磨至完全溶解，用水稀释至250mL。

活性人造沸石：称取200g 0.25mm（40目）～0.42mm（60目）的人造沸石于2000mL试剂瓶中，加入10倍于其体积的接近沸腾的热乙酸溶液，振荡10min，静置后，弃去上清液，再加入热乙酸溶液，重复一次；再加入5倍于其体积的接近沸腾的热250g/L氯化钾溶液，振荡15min，倒出上清液；再加入乙酸溶液，振荡10min，倒出上清液；反复洗涤，最后用水洗直至不含氯离子。

氯离子的定性鉴别方法：取1mL上述上清液（洗涤液）于5mL试管中，加入几滴0.01mol/L硝酸银溶液，振荡，观察是否有浑浊产生，如果有浑浊说明还含有氯离子，继续用水洗涤，直至不含氯离子为止。将此活性人造沸石于水中冷藏保存备用。使用时，倒入适量于铺有滤纸的漏斗中，沥干水后称取约8.0g倒入充满水的层析柱中。

（3）标准品 盐酸硫胺素（C₁₂H₁₇ClN₄OS·HCl），CAS：67-03-8，纯度≥99.0%。

（4）标准溶液配制 维生素B₁标准储备液（100μg/mL）：准确称取经氯化钙或者五氧化二磷干燥24h的盐酸硫胺素112.1mg（精确至0.1mg），相当于硫胺素为100mg，用0.01mol/L盐酸溶液溶解，并稀释至1000mL，摇匀。于0～4℃冰箱避光保存，保存期为3个月。

维生素B₁标准中间液（10.0μg/mL）：将标准储备液用0.01mol/L盐酸溶液稀释10倍，摇匀，在冰箱中避光保存。

维生素B₁标准使用液（0.100μg/mL）：准确移取维生素B₁标准中间液1.00mL，用水稀释、定容至100mL，摇匀。临用前配制。

（5）设备 荧光分光光度计，离心机：转速≥4000r/min，pH计：精度0.01，电热恒温箱，盐基交换管或层析柱（60mL，300mm×10mm内径），天平：感量为0.01g和0.01mg。

3.检测步骤

（1）试样预处理 用匀浆机将样品均质成匀浆，于冰箱中冷冻保存，用时将其解冻混匀。干燥试样取不少于150g，将其全部充分粉碎备用。

（2）提取 准确称取适量试样（估计其硫胺素含量约为10～30μg，一般称取2～10g试样），置于100mL锥形瓶中，加入50mL 0.1mol/L盐酸溶液，使得样品分散开，将样品放入恒温箱中于121℃水解30min，结束后，凉至室温后去除。用2mol/L乙酸钠溶液调pH为4.0～5.0或者用0.4g/L溴甲酚绿溶液为指示剂，滴定至溶液由黄色转变为蓝绿色。

酶解：于水解液中加入2mL混合酶液，于45～50℃恒温箱中保温过夜（16h）。待溶液凉至室温后，转移至100mL容量瓶中，用水定容至刻度。混匀、过滤，即得提取液。

（3）净化 装柱：根据待测样品的数量，取适量处理好的活性人造沸石，经滤纸过滤后，放在烧杯中。用少许脱脂棉铺于盐基交换管柱（或层析柱）的底部，加水将棉纤维中的气泡排出，关闭柱塞，加入约20mL水，再加入约8.0g（以湿重计，相当于干重1.0～1.2g）经预先处理的活性人造沸石，要求保持盐基交换管中液面始终高过活性人造沸石。活性人造沸石柱床的高度对维生素B₁测定结果有影响，高度不低于45mm。

样品提取液的净化：准确加入20mL上述提取液于上述盐基交换管柱（或层析柱）中，使通过活性人造沸石的硫胺素总量约为2～5μg，流速约为1滴/s。加入10mL近沸腾的热水冲洗盐基交换柱，流速约为1滴/s，弃去淋洗液，如此重复三次。于交换管下放置25mL刻度试管用于收集洗脱液，分两次加入20mL温度约为90℃的酸性氯化钾溶液，每次10mL，流速为1滴/s。待洗脱液凉至室温后，用250g/L酸性氯化钾定容，摇匀，即为试样净化液。标准溶液的处理：重复上述操作，取20mL维生素B₁标准使用液（0.1μg/mL）代替试样提取液，同上用盐基交换管（或层析柱）净化，即得到标准净化液。

（4）氧化 将5mL试样净化液分别加入A、B两支已标记的50mL离心管中。在避光条件下将3mL 150g/L氢氧化钠溶液加入离心管A，将3mL碱性铁氰化钾溶液加入离心管B，涡旋15s；然后各加入10mL正丁醇，将A、B管同时涡旋90s。静置分层后吸取上层有机相于另一套离心管中，加入2～3g无水硫酸钠，涡旋20s，使溶液充分脱水，待测定。

用标准的净化液代替试样净化液重复上述的操作。

（5）荧光强度的测定 测定条件：激发波长365nm；发射波长435nm；激发波狭缝5nm；

①试样空白荧光强度（试液反应瓶A）；

②标准空白荧光强度（标准反应瓶A）；

③试样荧光强度（试样反应瓶B）；

④标准荧光强度（标准反应瓶B）。(www.xing528.com)

4.结果计算

式中 X——样品中维生素B₁（硫胺素计）含量，mg/100g；

U——试样荧光强度；

U_b——试样空白荧光强度；

S——标准荧光强度；

S_b——标准空白强度；

ρ₁——硫胺素标准使用液浓度，μg/mL；

V——用于净化的硫胺素标准使用液体积，mL；

V₁——试样水解后定容之体积，mL；

V₂——试样用于净化的提取液体积，mL；

ρ₂——硫胺素标准使用液浓度，μg/mL；

m——试样质量，g；

——样品含量由μg/g换算成mg/100g的系数。

5.说明

（1）本法适用于各类食物中硫胺素的测定，但不适用于有吸附硫胺素能力的物质和含有影响噻嘧色素荧光物质的样品。

（2）检出限为0.04mg/100g，定量限为0.12mg/100g。

1.原理

核黄素在440～500nm波长光照射下发生黄绿色荧光，在稀溶液中其荧光强度与核黄素的浓度成正比，在波长525nm下测定其荧光强度，试液再加入低亚硫酸钠（Na₂S₂O₄）将核黄素还原为无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。

2.试剂及设备

（1）试剂2.5mol/L无水乙酸钠溶液，硅镁吸附剂（60～100目），10%木瓜蛋白酶（用2.5mol/L乙酸钠配制，使用时现配），10%淀粉酶（用2.5mol/L乙酸钠配制，使用时现配），0.1mol/L盐酸，0.1mol/L NaOH，1mol/L NaOH，20%低亚硫酸钠溶液（用时现配，保存于冰水浴中，4h内有效），洗脱液（丙酮∶冰乙酸∶水=5∶2∶9），0.04%溴甲酚绿指示剂（称取0.1g溴甲酚绿于研钵中，加1.4mL 0.1mol/L NaOH溶液研磨，加少许水，继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250mL），3% KMnO₄溶液，3% H₂O₂溶液。实验用水为蒸馏水，试剂不加说明为分析纯。

核黄素标准使用溶液：吸取2.00mL核黄素标准储备液（25μg/mL），置于50mL棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，避光，储于4℃冰箱，可保存1周，此溶液每毫升相当于1.00μg核黄素。

（2）设备 实验室常用设备，高压消毒锅，电热恒温培养箱，核黄素吸附柱，荧光分光光度计。

3.检测步骤

（1）样品提取

①水解：称取2～10g样品（约含10～20μg核黄素）于100mL三角瓶中，加入50mL 0.1mol/L的盐酸，搅拌直到颗粒物分散均匀，用40mL瓷坩埚为盖扣住瓶口，置于高压锅内高压水解，103kPa 30min，水解液冷却后，滴加1mol/L NaOH，取少许溶液，用0.04%溴甲酚绿检验呈草绿色，pH4.5。

②酶解：a.含有淀粉的水解液：加入3mL 10%淀粉酶溶液，于37～40℃保温约16h。

b.含高蛋白的水解液：加入3mL 10%木瓜蛋白酶溶液，于37～40℃保温约16h。

③过滤：上述酶解液定容至100.0mL，用干滤纸过滤，此提取液在4℃冰箱中可保存一周。

（2）氧化去杂质 取一定体积的样品提取液及核黄素标准使用液（约含1～10μg核黄素）分别于20mL的带盖刻度试管中，加水至15mL，各管加0.5mL冰乙酸，加3% KMnO₄溶液0.5mL，混匀，放置2min，使氧化去杂质，滴加3%双氧水溶液数滴，直至KMnO₄的颜色褪去，剧烈振摇试管，使多余的O₂逸出。

（3）吸附和洗脱

①核黄素吸附柱：硅镁吸附剂约1g用湿法装入柱，占柱长1 /2～2/3（约5cm）为宜，吸附柱下端用一小团脱脂棉垫上，勿使柱内产生气泡，调节流速约为60滴/min。

②过柱与洗脱：将全部氧化后的样液及标准液通过吸附柱后，用20mL热水洗去样品中的杂质。然后用5.00mL洗脱液将样品中的核黄素洗脱并收集于一带盖10mL刻度试管中，再用水洗吸附柱，收集洗出之液体并定容至10mL，混匀后待测荧光。

（4）测定 于激发光波长440nm，发射光波长525nm，测量样品管及标准管的荧光值，待样品及标准的荧光值测量后，在各管的剩余液（约5～7mL）中加0.1mL 20%的低亚硫酸钠溶液，立即摇匀，在20s内测出各管的荧光值，作为各自的空白值。

4.结果计算

式中 X——样品中核黄素的含量，mg/100g；

C——标准管荧光值；

A——样品管荧光值；

D——标准管空白荧光值；

B——样品管空白荧光值；

f——稀释倍数；

m——样品质量，g；

m′——标准管中的核黄素含量，μg；

——将样品中核黄素量由μg/g折算成μg/100g的折算系数。

5.说明

整个过程需避光进行；因核黄素在碱性溶液中不稳定，因而加NaOH时应边摇边加，防止局部碱度过大，破坏核黄素。

1.原理

试样中的抗坏血酸用偏磷酸溶解超声提取后，以离子对试剂为流动相，经反相色谱柱分离，其中L（+）－抗坏血酸和D（+）－抗坏血酸直接用配有紫外检测器的液相色谱仪（波长245nm）测定；试样中的L（+）－脱氢抗坏血酸经L－半胱氨酸溶液进行还原后，用紫外检测器（波长245nm）测定L（+）－抗坏血酸总量，或减去原样品中测得的L（+）－抗坏血酸含量而获得L（+）－脱氢抗坏血酸的含量。以色谱峰的保留时间定性，外标法定量。

2.试剂与设备

（1）试剂 偏磷酸（HPO₃）_n：含量（以HPO₃计）≥38%，磷酸三钠（Na₃PO₄· 12H₂O），磷酸二氢钾（KH₂PO₄），磷酸（H₃PO₄）：85%，L－半胱氨酸（C₃H₇NO₂S）：优级纯，十六烷基三甲基溴化铵（C₁₉H₄₂BrN）：色谱纯，甲醇（CH₃OH）：色谱纯。

（2）试剂配制 偏磷酸溶液（200g/L）：称取200g（精确至0.1g）偏磷酸，溶于水并稀释至1L，此溶液于4℃的环境下可保存一个月；

偏磷酸溶液（20g/L）：量取50mL 200g/L偏磷酸溶液，用水稀释至500mL；

磷酸三钠溶液（100g/L）：称取100g（精确至0.1g）磷酸三钠，溶于水并稀释至1L。

L－半胱氨酸溶液（40g/L）：称取4g L－半胱氨酸，溶于水并稀释至100mL，临用时配制。

（3）标准品L（+）－抗坏血酸标准品（C₆H₈O₆）：纯度≥99%，D（+）－抗坏血酸（异抗坏血酸）标准品（C₆H₈O₆）：纯度≥99%。

（4）标准溶液配制L（+）－抗坏血酸标准贮备溶液（1.000mg/mL）：准确称取L（+）－抗坏血酸标准品0.01g（精确至0.01mg），用20g/L的偏磷酸溶液定容至10mL。该贮备液在2～8℃避光条件下可保存一周。

D（+）－抗坏血酸标准贮备溶液（1.000mg/mL）：准确称取D（+）－抗坏血酸标准品0.01g（精确至0.01mg），用20g/L的偏磷酸溶液定容至10mL。该贮备液在2～8℃避光条件下可保存一周。

（5）设备 液相色谱仪：配有二极管阵列检测器或紫外检测器，pH计：精度为0.01，天平：感量为0.1g、1mg、0.01mg，超声波清洗器，离心机：转速≥4000r/min，均质机，滤膜：0.45μm水相膜，振荡器。

3.检测步骤

整个检测过程尽可能在避光条件下进行。

（1）试样制备 液体或固体粉末样品：混合均匀后，应立即用于检测。水果、蔬菜及其制品或其他固体样品：取100g左右样品加入等质量20g/L的偏磷酸溶液，经均质机均质并混合均匀后，应立即测定。

（2）试样溶液的制备 称取相对于样品约0.5～2g（精确至0.001g）混合均匀的固体试样或匀浆试样，或吸取2～10mL液体试样［使所取试样含L（+）－抗坏血酸约0.03～6mg］于50mL烧杯中，用20g/L的偏磷酸溶液将试样转移至50mL容量瓶中，振摇溶解并定容。摇匀，全部转移至50mL离心管中，超声提取5min后，于4000r/min离心5min，取上清液过0.45μm水相滤膜，滤液待测［由此试液可同时分别测定试样中L（+）－抗坏血酸和D（+）－抗坏血酸的含量］。

（3）试样溶液的还原 准确吸取20mL上述离心后的上清液于50mL离心管中，加入10mL 40g/L的L－半胱氨酸溶液，用100g/L磷酸三钠溶液调节pH至7.0～7.2，以200次/min振荡5min。再用磷酸调节pH至2.5～2.8，用水将试液全部转移至50mL容量瓶中，并定容至刻度。混匀后取此试液过0.45μm水相滤膜后待测［由此试液可测定试样中包括脱氢型的L（+）－抗坏血酸总量］。

若试样含有增稠剂，可准确吸取4mL经L－半胱氨酸溶液还原的试液，再准确加入1mL甲醇，混匀后过0.45μm滤膜后待测。

（4）仪器参考条件 色谱柱：C₁₈柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm，或同等性能的色谱柱。

检测器：二极管阵列检测器或紫外检测器。

流动相：A：6.8g磷酸二氢钾和0.91g十六烷基三甲基溴化铵，用水溶解并定容至1L（用磷酸调pH至2.5～2.8）；B：100%甲醇。按A∶B=98∶2混合，过0.45μm滤膜，超声脱气。

流速：0.7mL/min；检测波长：245nm；柱温：25℃；进样量：20μL。

（5）标准曲线制作 分别对抗坏血酸混合标准系列工作溶液进行测定，以L（+）－抗坏血酸（或D（+）－抗坏血酸）标准溶液的质量浓度（μg/mL）为横坐标，L（+）－抗坏血酸（或D（+）－抗坏血酸）的峰高或峰面积为纵坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。

（6）试样溶液的测定 对试样溶液进行测定，根据标准曲线得到测定液中L（+）－抗坏血酸［或D（+）－抗坏血酸］的浓度（μg/mL）。

（7）空白试验 空白试验系指除不加试样外，采用完全相同的检测步骤、试剂和用量，进行平行操作。

4.结果计算

试样中L（+）－抗坏血酸［或D（+）－抗坏血酸］的含量和L（+）－抗坏血酸总量以毫克每百克表示，按下式计算：

式中 X——试样中L（+）－抗坏血酸［或D（+）－抗坏血酸、L（+）－抗坏血酸总量］的含量，mg/10g；

ρ₁——样液中L（+）－抗坏血酸［或D（+）－抗坏血酸］的质量浓度，μg/mL；

ρ₂——样品空白液中L（+）－抗坏血酸［或D（+）－抗坏血酸］的质量浓度，μg/mL；

V——试样的最后定容体积，mL；

m——实际检测试样质量，g；

1000——换算系数（由μg/mL换算成mg/mL的换算因子）；

F——稀释倍数（若使用“试样溶液的还原”步骤时，即为2.5）；

K——若使用“试样溶液的还原”中甲醇沉淀步骤时，即为1.25；

100——换算系数（由mg/g换算成mg/100g的换算因子）。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

5.说明

固体样品取样量为2g时，L（+）－抗坏血酸和D（+）－抗坏血酸的检出限均为0.5mg/100g，定量限均为2.0mg/100g。液体样品取样量为10g（或10mL）时，L（+）－抗坏血酸和D（+）－抗坏血酸的检出限均为0.1mg/100g（或0.1mg/100mL），定量限均为0.4mg/100g（或0.4mg/100mL）。