丙二醇的生产技术及应用

1，3-丙二醇（CAS：504-63-2），可以用化学法生产，也可以用生物法生产。国际市场主要由Degussa公司、Shell公司和Du Pont公司三家垄断[3]。Degussa采用的生产方法是丙烯醛法，通过水合作用将丙烯醛转换成3-羟基丙醛（3-HPA），对3-羟基丙醛加氢生成1，3-丙二醇；Shell公司采用环氧乙烷法生产1，3-丙二醇。Du Pont公司采用生物法生产1，3-丙二醇，主要是以葡萄糖为原料，通过高效率基因工程菌发酵生产1，3-丙二醇。

化学法生产1，3-丙二醇需要在高温、高压下进行，还生成有毒物质3-羟基丙醛，生产条件苛刻，反应选择性差，副产物多。用微生物发酵法生产1，3-丙二醇，反应条件温和、环境友好，被以为是最有前途和最有指望的生产方法。生物基PTT是指1，3-丙二醇，是用可再生资源为原料、生物法得到的。微生物法生产1，3-丙二醇的技术瓶颈有几点，比如微生物制造1，3-丙二醇的效率，包括产率和原料到1，3-丙二醇的转化率。最大的技术难点是如何用成本可行的纯化工艺得到满足PTT聚合要求的高质量产品。

1.生产1，3-丙二醇的菌株改造

早在19世纪80年代，August Freund就发现了Clostridium pasteurianum能代谢甘油生成1，3-丙二醇[4]。

一个世纪以前，人们就发现了自然界中的微生物可以利用甘油来合成1，3-丙二醇。能够发酵甘油合成1，3-丙二醇的微生物大多是厌氧或兼性厌氧细菌，主要有肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌[5]、柠檬酸杆菌[6]、短乳杆菌[4]、梭状芽孢杆菌、丁酸梭状芽孢杆菌[7]等。肠杆菌属和梭状芽孢杆菌属的菌株利用甘油为唯一碳源，乳酸杆菌属的菌株主要利用发酵糖和甘油共发酵，甘油是最终电子受体。梭状芽孢杆菌属的菌株则只能在严格厌氧环境下代谢甘油，但是肠杆菌和乳酸杆菌能够在厌氧或兼性厌氧环境下代谢甘油。自然界中1，3-丙二醇产生菌都是采用甘油作为底物的，不能直接利用葡萄糖来合成1，3-丙二醇。

微生物代谢甘油分为氧化和还原两个途径[8]。氧化途径是甘油脱氢酶将甘油氧化为2-羟基丙酮（DHA），DHA进一步生成磷酸二羟丙酮、丙酮酸，丙酮酸进而再代谢生成乙酸、乳酸等副产物。丙酮酸代谢过程同时产生ATP和NADH，提供能量和还原力。还原途径是甘油在甘油脱水酶作用下脱水生成3-羟基丙醛，自然界中，有的甘油脱水酶需要在辅酶维生素B12的辅助下才能进行有效催化，可以通过对酶进行分子定向进化和定点突变或者选择不依赖辅酶维生素B12的甘油脱水酶，降低生产成本。丁酸梭菌的甘油脱水酶并不依赖辅酶维生素B12。3-羟基丙醛进一步在1，3-丙二醇氧化还原酶作用下消耗还原力NADH或NADPH形成1，3-丙二醇。在底物限制条件下，甘油脱水酶是产物生成的限速酶；底物过量时，1，3-丙二醇氧化还原酶是限速酶[9]，造成3-HPA的累积，从而抑制细胞生长和代谢。

用甘油为原料合成1，3-丙二醇研究较多的微生物是肺炎克雷伯氏杆菌和丁酸梭菌。肺炎克雷伯氏杆菌在有氧、微氧或厌氧的条件下都能以甘油为底物较快速地生长，但副产物较多，副产2，3-丁二醇、乙酸、乙醇以及乙偶姻（3-羟基-2-丁酮）、乳酸、琥珀酸等；丁酸梭菌需要严格厌氧，生长较慢，副产丁酸和乙酸。近几年，也有研究者用微生物菌群来利用甘油生产1，3-丙二醇。

自然界微生物合成1，3-丙二醇的效率远远不能满足工业化需要，需要通过基因工程、酶工程和代谢工程来提高微生物合成1，3-丙二醇的效率。主要的方向可以从以下几个方面入手：一是强化产物代谢流，解决限速反应所带来的负面影响，提高关键酶的表达量；二是副反应的阻断，通过敲除或者弱化副反应的酶活性或者表达量，减少副反应，提高发酵转化率；三是优化次级代谢途径，加强能量代谢和增加必需的酶活辅助因子；四是通过转基因技术利用葡萄糖或者更廉价碳源直接发酵得到甘油。

以甘油为底物合成1，3-丙二醇的微生物改造主要涉及对甘油氧化途径和还原途径的一些酶进行改造，主要是阻断一些副产物的生成，强化代谢流流向目的产物。如2009年，Seo等人通过对甘油氧化途径中的甘油脱氢酶基因敲除，可以消除代谢副产物[10]。2010年，Horng等人通过敲除甘油脱氢酶基因和二羟丙酮激酶，副产物乳酸的含量大大降低[11]。在还原途径中过量表达甘油脱水酶和1，3-丙二醇氧化还原酶可以提高1，3-丙二醇的合成。甘油脱水酶被发现是一种关键限速酶，甘油脱水酶是以维生素B12为辅酶的复合酶。在正常的甘油催化代谢循环中，维生素B12某一时期会处于失活状态，失活的维生素B12牢牢地束缚在甘油脱水酶上，从而终止催化反应。只有在甘油脱水酶复活酶（GDHtreactivase）的帮助下，维生素B12才脱离甘油脱水酶恢复活性[12]。提高甘油脱水酶的表达和活性或者构建不依赖维生素B12的甘油脱水酶将有利于1，3-丙二醇的生产。丙酮酸激酶是甘油氧化代谢途径的限速酶，丙酮酸的裂解是限速步骤，裂解速度会限制还原当量的产生，提高该酶的活性对1，3-丙二醇的生产也将会非常有利。

微生物用甘油为原料合成1，3-丙二醇理论摩尔转化率为0.72，因此该方法工业可行性依赖于甘油的价格，用代谢工程对菌种进行改造，改造的微生物可以利用葡萄糖为碳源来生产1，3-丙二醇，从而解决精制甘油为原料的成本高的问题。野生型大肠杆菌不具备将葡萄糖转化为甘油和1，3-丙二醇的能力，需要将葡萄糖到1，3-丙二醇合成的酶系通过在大肠杆菌的异源表达来实现。比较有代表性的工作是Du Pont和杰能科公司合作，从20世纪90年代开始至今不断地对微生物进行改造，构建以葡萄糖为原料生产1，3-丙二醇的高效率基因工程菌。WO9635796公开了Du Pont构建的大肠杆菌具有甘油脱水酶活性可以将以葡萄糖合成1，3-丙二醇。WO992480公开了类似的方法，在大肠杆菌异源表达该3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油磷酸化酶的一种或两种，并且破坏内源表达的甘油激酶和甘油脱氢酶的一种或两种；WO9821339公开了构建的大肠杆菌异源表达3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油磷酸化酶、脱水酶和1，3-丙二醇氧化还原酶。WO9821341公开了构建的菌株具有脱水酶活性和X蛋白。WO2001012833公开了非特异性催化3-羟基丙醛到1，3-丙二醇可以大幅度提高1，3-丙二醇的产率，该催化区别于1，3-丙二醇氧化还原酶的特异性催化。U.S.Ser No.10/420587（2003）公开了用于产1，3-丙二醇基因工程菌的载体和质粒。US7371588B2公开了高产1，3-丙二醇的基因工程菌构建方法，包括消除葡萄糖磷酸丙酮酸转运系统，对半乳糖质子转运体的galP基因上调，对3-磷酸甘油醛脱氢酶下调等工作，大幅度提高了1，3-丙二醇的产率和葡萄糖到1，3-丙二醇的转化率。US2011/0136190公开了构建的微生物具有转化蔗糖合成1，3-丙二醇的能力，构建的菌株具有蔗糖激酶和蔗糖水解酶活性。通过系统的基因工程、代谢工程改造，Du Pont构建的菌株可以高效率生产1，3-丙二醇，并且投入到商业化生产。

2.1，3-丙二醇的发酵工艺优化

基于所用的微生物和原料的不同，微生物生产1，3-丙二醇的发酵工艺有以下几种。

（1）以甘油为原料，纯种微生物生产1，3-丙二醇。Menzel K等人通过控制发酵过程中的甘油浓度的策略，1，3-丙二醇的浓度达到48g/L，摩尔转化率达到0.63[13]。利用甘油为原料生产1，3-丙二醇，为了提高发酵效率，往往添加葡萄糖或者采用微氧发酵来提高发酵强度。添加葡萄糖可以为细胞生长提供碳源，提供还原力，可以提高甘油到1，3-丙二醇的转化率。如甘油和葡萄糖的共底物发酵的化学计量分析，甘油可以100%转化为1，3-丙二醇[14]。相对于厌氧发酵，微氧发酵更利于ATP的合成，可以提高生产强度[5]。此外为了降低成本，人们还开发了以废甘油为原料的微生物和发酵工艺。(www.xing528.com)

（2）以甘油为原料，混菌发酵生产1，3-丙二醇。Temudo等筛选出利用甘油生产1，3-丙二醇的混合菌群，主产物为乙醇，1，3-丙二醇的摩尔转化率为0.16[15]。

大连理工大学从海泥中筛选出兼性微生物菌群，可以将甘油转化为1，3-丙二醇，1，3-丙二醇产量达到81.40g/L，甘油到1，3-丙二醇的摩尔转化率为0.63mol/mol[16]。

（3）以葡萄糖为原料，利用构建的高效率基因工程菌纯种发酵生产1，3-丙二醇。典型代表是Du Pont开发的菌株和发酵工艺，发酵强度高，转化率高。Du Pont还构建了具有高的蔗糖转运能力、高的果糖激酶活性和高的蔗糖水解酶活性的基因工程菌，该菌株可以利用蔗糖为原料生产1，3-丙二醇。

（4）以葡萄糖为原料，混菌培养生产1，3-丙二醇。混合培养酵母等甘油产生菌和肠道细菌等1，3-丙二醇产生菌，从而实现由葡萄糖转化为1，3-丙二醇，解决原料问题。如Ma等人[17]利用两种微生物将葡萄糖转化为1，3-丙二醇，浓度达到了15.2g/L。这种发酵方式由于两种菌培养条件的差异，导致终产物浓度低，很难达到高的生产效率。

综上工艺，目前商业化最成功的还是Du Pont开发的以葡萄糖为原料，纯种微生物发酵生产1，3-丙二醇的工艺，该工艺依赖于高效率基因工程菌的构建。

3.生物法1，3-丙二醇的纯化

1，3-丙二醇发酵液成分复杂，除了1，3-丙二醇外，还含有菌体、蛋白、糖、有机酸、氨基酸以及盐类等杂质。另外，产物浓度低，产物在水相体系，使得蒸发、精馏等工段能耗高，而且采用高温纯化的过程，一些杂质变性可能会造成体系的复杂性。进一步需要了解的是1，3-丙二醇在下游应用的质量要求，在纯化的每个步骤考虑可能影响产品质量的因素。如何用经济高效的纯化方法得到满足PTT聚合要求的高质量产品是1，3-丙二醇产业化的重要瓶颈问题。

从1，3-丙二醇发酵液纯化产品，需要考虑几个步骤。首先将发酵液的菌体进行分离，得到不含菌体的1，3-丙二醇水相体系，这个过程可以通过过滤、离心等方式得到；其次是将1，3-丙二醇从水相体系中分离出来，这可能涉及过滤、蒸发、萃取、结晶等物理过程。最后通过进一步精制，将少量杂质去掉，得到满足需求的1，3-丙二醇产品。

Du Pont专利US8183417公开了用微滤、超滤和纳滤结合去除大分子物质和盐类物质，并且可见颜色减少了90%，可以减少后续离子交换和蒸馏的负担。Du Pont将脱盐浓缩后的1，3-丙二醇发酵液先分别经过精馏，脱除其中的轻组分和重组分，1，3-丙二醇料液再经过加氢过程脱除其中的醛、酮等容易产生颜色的物质，再经进一步精馏脱除加氢过程转化成的轻组分、重组分，最终得到1，3-丙二醇，产品质量符合制备高性能PTT的要求。

采用合适的纯化工艺将发酵液中的盐分去除可以减少后续的提取步骤的负担，从而可以提高产品质量。文献中报道的常用脱盐方法有离子交换、电渗析、盐析法、酸析法、双水相萃取及有机溶剂萃取等。不同的脱盐方法都有各自的优缺点，如离子交换过程需频繁再生，消耗酸碱，产生大量的废水，造成环境污染；电渗析存在着膜污染影响效率以及膜价格昂贵的问题；多级萃取工艺无机盐的回收需浓缩萃余相，回收困难，成本高。

超临界萃取可以替代传统精馏过程，来纯化1，3-丙二醇，流程简单、能耗低。但是超临界萃取多为高压设备，设备处理量小、设备投资高。

专利US6361983公开了在发酵液中加碱，提高发酵液的pH到7.0以上，可以减少在高温处理下而导致的醇、酸、醛类的相互反应、醇脱氢反应和产品颜色问题。特别是用氢氧化钙调节发酵液pH导致的副反应比用其他碱处理和不用碱处理产生的杂质少。