生物基1，5-戊二胺的简易制备方法

化学法合成的己二胺，被广泛应用在脂肪族异氰酸酯、聚酰胺等高端应用领域。而奇数碳的戊二胺很难用化学法合成。

1，5-戊二胺，又名戊二胺、尸胺、1，5-二氨基戊烷，是一种多胺。1，5-戊二胺在常温下为黏稠状液体，易溶于水、乙醇。1，5-戊二胺沸点较高，为178～180℃，有刺激性气味，易燃、有一定毒性。1，5-戊二胺在腐烂的尸体和动物精液中可以分离得到。戊二胺、腐胺、精胺是生物活性细胞必不可少的组成成分，在调节核酸和蛋白质的合成及生物膜稳定性方面起着重要的作用[2]。

在工业上，戊二胺具有广泛的应用前景。用戊二胺可以合成新型异氰酸酯[3]。用戊二胺合成的新型异氰酸酯与现有的用己二胺合成的异氰酸酯相比，其覆盖效应增强，有更好的抗化学腐蚀能力，有更强的耐磨性、耐黄变、上料涂膜均匀、更环保等优点，具有较好的市场前景。1935年，美国科学家Carothers用戊二胺和癸二酸聚合得到聚酰胺510[1]。用戊二胺和不同碳链长的二元酸聚合可以得到不同的新型聚酰胺，如聚酰胺54、聚酰胺56、聚酰胺512、聚酰胺514等。聚酰胺由于具备良好的力学性能、耐热性、耐磨损性、耐化学腐蚀性、自润滑等优点[4]位列五大工程塑料之首，广泛应用于航空领域、包装材料、纺织领域、家用电器、汽车零件制造以及医疗等领域。目前，全世界的聚酰胺市场需求大约为700万吨，主要品种为聚酰胺6和聚酰胺66。聚酰胺6和聚酰胺66都是以石油为原料采用化学法生产。合成聚酰胺66的原料单体己二胺长期被国外少数几个公司垄断，中国完全依赖进口。自1935年发明聚酰胺66以来，中国进口己二胺的局面维持了将近80年，时至今日还没有明显的突破，这极大地限制了中国聚酰胺行业的发展，并威胁着国家的战略安全。

用戊二胺合成的聚酰胺属于碳原子数奇偶搭配的聚酰胺，与普通聚酰胺6和聚酰胺66偶数碳聚酰胺相比，碳原子数奇偶搭配的聚酰胺具备密度更低、尺寸稳定性更好、视觉性能更好等优异性能而受到市场的青睐[5]。由于用戊二胺和己二酸聚合得到的聚酰胺56链之间的氢键含量低，因此在弹性、阻燃性、流动性方面都展示了优于聚酰胺6和聚酰胺66的优点。聚酰胺56被纺织行业认为是最有前途的化纤材料之一，它的吸水性、透气性、可染色性、高弹性、阻燃性能都具有显著的优势。

1.戊二胺的生产方法

在腐烂的尸体与精液中可以检测到戊二胺，在富含氨基酸、蛋白质的肉制品、水产品和发酵制品中也有一定量的戊二胺。戊二胺在上述物质中含量低，提取成本较高，不适合规模化生产。戊二胺也可以通过化学法或通过生物法合成。

化学法合成戊二胺的研究相对较少，Hashimoto等[6]通过化学方法对L-赖氨酸进行脱羧反应来制备戊二胺。李崇等[7]采用非晶态镍为催化剂，利用戊二腈加氢来制备戊二胺，其反应过程为：戊二腈在非晶态镍的催化下加氢生成5-氨基戊腈，随后5-氨基戊腈进一步催化下加氢生成戊二胺和副产物六氢嘧啶。研究发现，使用非晶态镍为催化剂，戊二腈的转化率明显高于骨架镍催化剂，但戊二胺的选择性较低。

生物法制造戊二胺经历了几十年的科研过程。近年来，随着生物技术，特别是生物合成技术的不断突破，生物法戊二胺的制造成为可能。凯赛生物产业技术有限公司在突破生物法戊二胺的技术瓶颈方面获得进展，先后在山东金乡建成了年产千吨级的生物法戊二胺和生物基聚酰胺中试生产线，在中国新疆乌苏建造年产5万吨级的戊二胺和10万吨聚酰胺产业化装置，这是全球第一条万吨级戊二胺生产线。

自从Tabor等[8]在培养大肠杆菌时发现了有微量的戊二胺的存在以来，人们开始研究发酵法生产戊二胺。研究者用葡萄糖为原料，通过基因工程、代谢工程等手段对微生物菌株进行改造，提高微生物合成戊二胺的能力。具体进展如下：

Nishi等[9]第一次报道了用微生物来生产戊二胺，采用的方法是在大肠杆菌中通过转入多拷贝质粒，过表达赖氨酸脱羧酶基因cadA，利用休止的重组大肠杆菌可以生产69g/L的戊二胺，使用的原料是L-赖氨酸。Qian等[10]通过引入强启动子Ptac过表达赖氨酸脱羧酶、敲除代谢戊二胺的speE、speG等基因，用强启动子Ptrc来过表达L-赖氨酸合成的dapA、lysC等基因，来提高大肠杆菌合成戊二胺的效率。构建的重组大肠杆菌XQ56可以以葡萄糖为原料生产戊二胺，发酵液中戊二胺含量为9.6g/L，葡萄糖到戊二胺的转化率为13%。Na等[11]通过设计合成小的调控RNA来识别和调控目标基因的表达，进一步通过基因工程构建阻遏murE的突变株，构建的基因工程菌可以合成12.6g/L的戊二胺，比出发菌株XQ56戊二胺合成能力有明显提高。

近年来，用谷氨酸棒状杆菌生产戊二胺得到了越来越多的研究。选择谷氨酸棒状杆菌为生产菌的主要原因是谷氨酸棒状杆菌的遗传背景比较清楚[12]，通过代谢工程、基因工程改造谷氨酸棒杆菌过量合成戊二胺的前体L-赖氨酸取得了很多进展[13-15]，而且与大肠杆菌相比，谷氨酸棒状杆菌可以耐受更高浓度的戊二胺[16]。Mimitsuka等[17]第一次将谷氨酸棒状杆菌中的高丝氨酸脱氢酶基因hom替换为大肠杆菌中的赖氨酸脱羧酶基因。微生物发酵法合成戊二胺的研究进展见表6-2。

表6-2　微生物发酵法合成戊二胺的研究进展

cadA来合成戊二胺，构建的基因工程菌发酵液的戊二胺含量为2.6g/L，另外还残留2.3g/L未转化的L-赖氨酸，葡萄糖到戊二胺的转化率为9.1%。Mimitsuka等以为产率低的主要原因是谷氨酸棒状杆菌缺少转运蛋白，生成的戊二胺不能被及时输送出胞外而对赖氨酸脱羧酶的活性产生抑制。Tateno等[19]采用组成型的强启动子，构建了共表达α-淀粉酶和大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因cadA的质粒，并将质粒转入谷氨酸棒状杆菌，用含有50g/L的可溶性淀粉的培养基进行培养，培养21h，发酵液戊二胺含量为23.4mmol/L，发酵液没有L-赖氨酸的累积。

Völkert等[23]通过代谢途径改造构建了能利用葡萄糖发酵生产戊二胺的谷氨酸棒状杆菌工程菌，发酵80h，戊二胺产量达到72.0g/L，但是发酵液中还累积了10g/L的N-乙酰戊二胺，15g/L的L-赖氨酸，葡萄糖到戊二胺的转化率低于15%。

Kind等[20]对谷氨酸棒状杆菌合成戊二胺的代谢途径进行了系统改造，包括将含有大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因ldcC的质粒转入谷氨酸棒状杆菌，随后通过密码子、启动子优化来提高ldcC在谷氨酸棒状杆菌的表达。Kind等又对谷氨酸棒状杆菌的中心代谢途径进行优化来增强底物到L-赖氨酸的代谢流。通过代谢工程的系统改造，葡萄糖到戊二胺的转化率提高到17%。Kind等发现构建的基因工程菌在合成戊二胺的同时也累积了副产物N-乙酰戊二胺，生成的N-乙酰戊二胺的量占戊二胺量的25%。Kind等[21]通过进一步的工作，删除了合成N-乙酰戊二胺的戊二胺转移酶，葡萄糖到戊二胺的转化率与对照相比提高了11%。为了解除胞内的戊二胺对L-赖氨酸的抑制，Kind等[16]通过代谢工程改造，提高谷氨酸棒状杆菌胞内的戊二胺的分泌效率。Kind观察到戊二胺合成时，有35个基因的转录水平上调，其中有一些关系到分泌功能的基因转录水平提高。他们通过将基因cg2893的野生型启动子替换为强启动子来提高渗透酶的表达，通过分泌性能的优化，葡萄糖到戊二胺的转化率提高到240mmol/mol葡萄糖，减少了70%以上的副产物N-乙酰戊二胺。

生物法合成戊二胺的另外一条途径是酶法制备戊二胺，酶法制备戊二胺的过程是培养微生物制备赖氨酸脱羧酶或者得到含有赖氨酸脱羧酶的微生物细胞，然后利用赖氨酸脱羧酶或者含有赖氨酸脱羧酶的微生物细胞直接催化底物L-赖氨酸生成戊二胺。与发酵法戊二胺相比，酶法制备戊二胺有一系列优点，如反应过程简单、不需要复杂的发酵调控；L-赖氨酸只被催化成戊二胺，没有副产物的累积；酶法制备戊二胺不用考虑戊二胺对微生物细胞的毒害作用等。国内外一些公司和学者对酶法制备戊二胺进行了研究，采用的策略主要是对野生型菌株产酶条件的优化、酶法催化过程的优化、通过多拷贝质粒提高赖氨酸脱羧酶的表达量等，主要的研究进展见表6-3。

表6-3　细胞催化合成戊二胺的研究进展

赖氨酸脱羧酶是生物法制备戊二胺的关键酶。人们发现，在很多微生物如大肠杆菌（Escherichia coli）、尸杆菌（Bacterium cadaveris）、蜂房哈夫尼（Hafnia alvei）、产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）等[27-30]都发现存在赖氨酸脱羧酶。大肠杆菌存在两种形式的赖氨酸脱羧酶，Gale等[31]发现了诱导型的赖氨酸脱羧酶CadA。诱导型的赖氨酸脱羧酶在环境pH比较低、有L-赖氨酸存在并且微生物在厌氧环境下容易被诱导合成[32]。Usheer和Irina[33]等分析了CadA的结晶结构，该蛋白是由5个二聚体缔合的十聚体结构，其单体可以被分为三个区域，三个区域分别是N-末端翅膀区域（氨基酸残基1-129），主区域（氨基酸残基130-563）和一个C-末端区域（氨基酸残基564-715）。主区域由连接区域和跟随的两个子域组成，这两个子域分别是磷酸吡哆醛PLP的结合子域（氨基酸残基184-417）和子域4（氨基酸残基418-563）。单体的活性部位被包埋，二聚体的界面形成的窄缝通向活性中心，二聚化对保持活性是必须的。

Usheer等[33]阐述了pH对大肠杆菌CadA的影响，当CadA蛋白浓度较低时，CadA蛋白的高级结构受pH影响非常明显。当pH在6.5时，有25%的二聚体和75%的十聚体，而当pH上升到8.0时，95%的CadA蛋白都解离成二聚体的形式存在。

Goldemberg等[34]在野生型大肠杆菌中发现了不耐热的赖氨酸脱羧酶，这与相对耐热的诱导型的赖氨酸脱羧酶的酶学性质不同，从而怀疑可能存在组成型的赖氨酸脱羧酶。Yamamoto等[27]报道了组成型的赖氨酸脱羧酶LdcC。Kikuchi等[35]也报道了大肠杆菌的组成型的赖氨酸脱羧酶LdcC。Lemonnier等[36]报道了赖氨酸脱羧酶LdcC，但是他们以为ldcC不是组成型表达，自身的启动子很弱，在正常条件下转录非常弱。

Lemonnier和Lane等[31]研究了大肠杆菌赖氨酸脱羧酶CadA和Ldc的酶学性质。Ldc在较宽泛的pH范围内都表现了良好的酶活性，最适pH为7.6。CadA的最适pH为5.5，pH在6.0以上，酶活性迅速下降。两种赖氨酸脱羧酶CadA和Ldc的最适反应温度都在52℃左右，但是随着温度的上升，Ldc失活速率远快于CadA。

Krithika等[37]研究了CadA和Ldc的酶学性质，温度稳定性研究表明，CadA和Ldc的温度稳定性基本一致，当温度达到80℃，CadA能保留65%的酶活，而Ldc能保留65%的酶活性。这和Lemonnier等的研究结果不同[36]。

Kikuchi等[35]对比了大肠杆菌赖氨酸脱羧酶LdcC、CadA以及来自于蜂房哈夫尼菌赖氨酸脱羧酶Ldc和鼠伤寒沙门氏杆菌的赖氨酸脱羧酶Ldc的氨基酸序列比对，相似度分别为69.4%、68.6%、68.9%。

2.生物法合成戊二胺的产业化技术瓶颈

21世纪以来，生物法合成戊二胺成为人们的研究热点，人们对微生物发酵和酶法制备戊二胺做了大量研究，但是直到目前都没有实现产业化，主要原因是生物法戊二胺存在以下产业化技术瓶颈，具体分析如下。

（1）戊二胺对微生物细胞有毒害作用。研究表明，当培养液的戊二胺浓度达到0.2mol/L时，大肠杆菌生长速率下降35%，当戊二胺浓度达到0.3～0.5mol/L时，培养液中部分菌体已发生裂解[38]。Kind等[16]的研究表明，当培养液中的戊二胺浓度在1mol/L时，谷氨酸棒状杆菌仍能保持对数生长，但是比生长率下降约67%。

（2）底物L-赖氨酸和产物戊二胺对赖氨酸脱羧酶有抑制作用。Krithika等[37]的研究结果表明，底物L-赖氨酸浓度对CadA和Ldc的酶活有影响，当L-赖氨酸浓度达到6mmol/L，就能抑制大肠杆菌赖氨酸脱羧酶CadA的活性。Sabo等[27]以为细胞内的戊二胺对赖氨酸脱羧酶的活性有抑制作用。Fritz等[39]的研究表明，1，5-戊二胺对Cad系统有抑制作用。Kind等[16]的研究表明，当戊二胺的浓度达到30mmol/L时，赖氨酸脱羧酶的酶活下降50%。(www.xing528.com)

（3）发酵法合成戊二胺的代谢途径复杂、副产物多。以葡萄糖为原料发酵法合成戊二胺涉及的代谢过程复杂，发酵液中除了含有戊二胺，还有一定量的L-赖氨酸，N-乙酰戊二胺。副产物多使得葡萄糖到产物的转化率低、后续纯化困难。文献表明在宿主内简单地过表达赖氨酸脱羧酶得到基因工程菌产戊二胺少、转化率低。如Qian等[10]得到的基因工程菌的发酵液中戊二胺含量为9.6g/L，葡萄糖到戊二胺的转化率为13%。Na等[11]得到的突变株的发酵液中戊二胺含量为12.6g/L。Mimitsuka等[17]构建的基因工程菌发酵液的戊二胺含量为2.6g/L，L-赖氨酸的含量为2.3g/L，葡萄糖到戊二胺的转化率为9.1%。Tateno等[19]构建的基因工程菌发酵液戊二胺含量为23.4mmol/L。Kind等[16]认为需要对合成戊二胺的代谢途径进行全局改造，才能提高戊二胺的产率，他们通过相关的系统改造，葡萄糖到戊二胺的转化率也只有17%。

（4）戊二胺在微生物体内的转运机制不清楚。关于戊二胺在微生物体内转运所涉及的蛋白和基因以及相关机制研究较少，Kind等[20]认为这也是生物法合成戊二胺的瓶颈之一。产物的转运机制对高效率表达产物并分泌出胞外非常重要，很多文献都通过对产物的转运蛋白进行研究来提高产物的合成效率[40-42]。尽管一些研究者对戊二胺的转运进行了研究，但还处于初步阶段，相关的机制还不是非常清楚[16]。

（5）赖氨酸脱羧酶活低、赖氨酸脱羧酶在碱性环境下不稳定，酶法制备戊二胺催化效率低。文献报道[33]，当pH上升到8.0时，95%的CadA蛋白由有活性的十聚体而解离成二聚体。

虽然研究者针对生物法合成戊二胺的代谢途径、关键酶进行了系列研究，但通过对文献的调研和凯赛的实验研究发现，研究对象和手段都相对单一，研究对象主要是大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶，研究手段大多采用引入强启动子、多拷贝质粒来提高赖氨酸脱羧酶的表达量，缺乏多样性酶种、物种等生物信息学的详细研究，对分子表达优化策略的集成、赖氨酸脱羧酶酶工业属性的定向改造等很少涉猎。

凯赛生物公司的研究团队，通过基因工程和代谢工程等各种手段对生产戊二胺的微生物菌株进行了改造，包括提高含合成戊二胺基因质粒的稳定性；通过改造微生物细胞膜结构，降低戊二胺对微生物的毒性；通过改造关键酶的结构提供酶的活性和稳定性；通过设置基因开关提高戊二胺的生产效率等一些列技术的创新和突破，催生了生物法戊二胺的产业化。

3.戊二胺的纯化

含戊二胺发酵液，去除细胞以后，液体颜色深，组成复杂，除戊二胺离子外，还含有大量的硫酸根离子以及糖和其他的代谢有机物。溶液杂质组成复杂，给后续的提取工艺带来很大难度。

戊二胺主要用来作为尼龙的聚合单体，生产全新的尼龙聚合物。尼龙聚合一般都在高温、高压的条件下进行，在这一过程中，单体当中微量的杂质，特别是不稳定化合物，会对尼龙的颜色、性能造成很大影响，甚至导致尼龙产品无法使用。尼龙聚合对戊二胺的产品质量提出了新的挑战。

戊二胺是生物代谢的中间产物之一，浓度过高，对生物体和环境造成一定的影响。为了控制戊二胺生产对环境的影响，需要考虑戊二胺生产工艺在各个环节采用最简单可靠的工艺，生产对绿色、环境友好的产品。

（1）戊二胺溶剂萃取路线。在多条工艺路线当中，溶剂萃取工艺是最常见的一条提取路线，很多日本和国内的公司都做过尝试[43-45]。这一工艺一般用强碱，如氢氧化钠与戊二胺盐反应，调节溶液pH在12以上，用有机溶剂，如丁醇等单一溶剂或混合溶剂，对水溶液中的戊二胺进行萃取，萃取得到的有机相经过蒸馏，可以得到戊二胺成品。

溶剂萃取工艺优点突出，采用有机溶剂可以在温和的条件下将戊二胺从水相转移到有机相，萃取过程中可以除去大部分杂质，经蒸馏得到的戊二胺产品纯度高、产品质量好。

溶剂萃取工艺最大的挑战是合适的萃取溶剂的筛选。合适萃取溶剂，首先，化学性质上不能与戊二胺反应，化学性质要稳定，否则有可能会影响后续的聚合反应。其次，因为戊二胺与水无限混溶，所以该溶剂需要有一定极性，否则对戊二胺萃取效率很低，但又不能过于亲水。

基于以上考虑，萃取工艺在实验室规模做了很多研究。但在工业放大的过程中，仍然面临很多问题。

首先，是萃取的效率和收率。文献当中，为达到高收率的萃取戊二胺，需要使用大量的有机溶剂反复萃取[43，44]，即便如此，最终萃取剩余的水溶液中仍然含有一定量的戊二胺，如0.5%以下，难以被完全萃取。其次，萃取结束后，水溶液中含有少量的胺和大量的无机盐、有机色素等物质，溶液生化处理困难，排放污染环境。

（2）戊二胺尼龙盐工艺。这一工艺的技术特点是将提取过程和后续的尼龙盐成盐过程有机地结合起来，避开了中间戊二胺的提取[46-40]。

传统工艺在酶转化结束以后，用强碱调节酶转化液生成大量无机盐，包括硫酸钠、碳酸钠等，处理困难。本工艺巧妙地采用赖氨酸的己二酸盐进行酶转化，转化结束以后直接得到戊二胺的己二酸盐，即所谓的尼龙盐，该化合物经过进一步处理，可以直接聚合得到尼龙产品。这一工艺避免了用强碱调节戊二胺溶液pH的过程，从而避免了大量无机盐的产生，节约了烧碱的使用，减少无机盐的排放，对环境非常友好。这一工艺不使用强碱，避免了后期蒸馏戊二胺，工艺流程短，能耗低，成本节约。

但在工业生产上，该工艺也面临一些挑战。

首先，该工艺需要使用纯的赖氨酸和纯的酶反应[47]。赖氨酸发酵液比较复杂，含有大量的无机阴离子、有机色素等。赖氨酸发酵液需要通过树脂等纯化工艺，才能得到纯的赖氨酸。其次，该工艺的产品质量有波动。在赖氨酸的提纯过程中，赖氨酸溶液中不可避免地会混有少量杂质，即使微量的杂质也会对尼龙聚合产生影响，需要在后期处理中去除。为了达到这一目的，研究人员使用了多种方法[48-49]，如有机膜过滤、尼龙盐结晶等，但即使采用这些方法，仍无法确保尼龙盐产品质量的批次稳定性。最后，本方法无法生产戊二胺，无法提供戊二胺产品给除尼龙外的其他有需要的客户，如有机合成客户或进行其他聚合物生产客户。

（3）戊二胺碳酸盐分解工艺。该工艺类似于尼龙盐工艺，但不采用己二酸来调节酶转化的pH，转而采用CO2来调节溶液pH，最后生成戊二胺的碳酸盐溶液。在得到戊二胺碳酸溶液后，通过加热等方法，促使戊二胺碳酸盐分解，蒸馏得到戊二胺产品[50-57]。

同样，与尼龙盐工艺一样，该工艺中间过程不使用强碱，节约了烧碱的使用，减少无机盐的排放，对环境非常友好。

但该工艺面临的问题与尼龙盐提取工艺类似。首先，需要使用纯的赖氨酸和纯的酶反应。其次，需要在高温下分解戊二胺碳酸盐，而戊二胺在高温下不稳定，容易发生成环反应，戊二胺长时间处于高温状态，对产品质量有很大影响。另外，戊二胺碳酸盐完全分解比较困难，在精馏塔内，残留的戊二胺碳酸盐会进一步分解，分解的CO2与戊二胺在塔内发生反应，在塔内件上凝结，容易造成堵塞。

（4）戊二胺直接蒸发工艺。该工艺采用戊二胺酶转化液，与强碱反应，经过浓缩蒸发直接得到戊二胺[58-62]。

该工艺对酶反应液的要求低，工艺流程短。但酶转化液与强碱反应生成大量无机盐，无机盐的总量甚至超过戊二胺的含量，在蒸馏过程中有大量的无机盐析出，并伴有高黏度的有机杂质，严重恶化蒸馏条件，戊二胺产品后期蒸发难度很大，需要特别的工艺或特殊的设备才能完成这一工序。

总之，戊二胺提取工艺的主要难点在于无机盐多、有机杂质多、污水处理难度大。目前工业上多条提取工艺路线都在研究，但每一条提取路线都有自己的问题。选取合适的提取工艺，高效地回收戊二胺产品是目前工业上主要的挑战之一。