甲壳素脱乙酰反应的机理及应用探析

甲壳素上C2位置上的乙酰基团转变成胺基，得到脱乙酰甲壳素这一过程通常被称为脱乙酰化反应。根据脱乙酰的反应机理，可以分为化学反应脱乙酰和生物方法脱乙酰，而化学反应脱乙酰根据反应的相态体系又可分为均相反应体系和非均相反应体系。

（一）脱乙酰反应原理

从甲壳素的结构式来看，可以归属于酰胺类的多糖。对于酰胺类羧酸衍生物来说，脱乙酰反应的实质可以看作是酰胺的水解反应，即酰基碳原子上的亲核取代反应。其反应机理是，亲核试剂进攻羰基碳原子，形成四面体结构中间体。在羧酸衍生物中，酰胺类物质进行水解反应是比较困难的，需要在H+或者OH-的催化下进行，即在强酸或者强碱的条件下进行，同时需要比较长的反应时间。

单纯从亲核取代反应机理来看，甲壳素的脱乙酰反应既可以在强酸或者强碱的反应条件下进行。但对于多糖类物质来说，强酸条件比强碱条件更容易发生糖苷键的水解，因此，甲壳素的脱乙酰反应通常在强碱性催化条件下进行。

在碱性条件下，首先电离出OH-离子，形成带负电的亲核试剂，然后首先攻击羰基碳，使原来平面三角形的酰胺基变成四面体过渡形态，负电荷逐渐转移到氧上，最终负电荷完全转移到氧原子，形成全部中间体。上述第一步过程为整个反应的第一步，整个反应存在平衡，是可逆的；第二步是碱性基团的离去，产生羧酸盐，这个过程不可逆，速率非常快，因而整个水解过程主要由第一步控制。整个反应历程如下。

在甲壳素的结构单元中，C2位的乙酰氨基和C3位置上的羟基处于反式结构，其稳定的化学结构给脱乙酰反应带来了困难。同时，在极强烈的反应条件下势必会带来副反应。在碱性条件下，由于甲壳素分子中存在苷键特殊结构，甲壳素分子链的降解反应也是能发生亲核取代反应。在相同条件下，酰胺碳的正电性大于苷键碳的正电性，因此，亲核取代反应主要发生在酰胺基上[35-51]。

（二）化学反应脱乙酰

1.均相反应体系

（1）碱熔法。通过甲壳素粉末与固体碱，在升温条件下直接进行脱乙酰反应。在1894年，Hoppe等就已经尝试通过这种办法得到部分乙酰基脱出的甲壳素，后来做了许多改进，比较多的做法如下。

将甲壳素与片状固体KOH在镍坩埚中，180℃反应30min，然后倒入乙醇中，生成胶状沉淀，用水洗至中性，再将粗产物溶解在5%的甲酸中，用NaOH溶液沉淀过滤洗至中性，重复三次。最后，将沉淀物洗净后溶解在50℃左右的稀盐酸中，再慢慢加入浓盐酸，直至出现沉淀，得到壳聚糖盐酸盐，具体化学式如图3-4所示。

Rogovina[52]等采用双螺杆挤压技术共融甲壳素与NaOH固体，控制水分含量的条件下，连续制备高脱乙酰度壳聚糖，甲壳素与NaOH的摩尔比为1∶5，反应温度在180℃的条件下，得到壳聚糖脱乙酰都可以达到90%，相对分子质量Mw为60000。李姚杰[53]也采用了类似的方法，得到了甲壳素脱乙酰化的最佳甲壳素/NaOH质量分数比为1.1，时间为28min，温度为177℃，得到的壳聚糖脱乙酰度为90.9%，特性黏度为27.65mL/g。

（2）水溶性甲壳素脱乙酰。另一类均相脱乙酰反应则是将甲壳素溶解于水中，在水相中脱出乙酰基。通常，只有在温和的反应条件下，才能保证脱乙酰反应速率可控制。当脱乙酰度高于50%时，甲壳素就很难溶解在水中。因此，对于水溶性甲壳素的脱乙酰反应，在实际其应用中的价值有限。Nemtsev等[54]提供了一种甲壳素均相脱乙酰的方法，将甲壳素溶解在13%～24%浓度的NaOH中，在低温恒温槽中经历明显的溶胀并形成碱性溶液，在室温或者适当加热条件下进行脱乙酰，溶液失去稳定产生凝胶，将凝胶过滤洗净并移除碱，得到壳聚糖，得到的壳聚糖相对分子质量为180000～300000，脱乙酰度最高可以达到95%。

2.非均相反应体系

（1）多级脱乙酰。非均相反应体系通常又被称为碱液法，是利用固体甲壳素与碱溶液在升温条件下脱出乙酰基，属于非均相反应，工艺流程如图3-5所示。由于甲壳素脱乙酰反应存在平衡，因此，想要得到高乙酰化程度的壳聚糖，往往需要进行多次的脱乙酰化过程。

图3-4　壳聚糖盐酸盐化学结构式

图3-5　碱液法脱乙酰流程示意图(www.xing528.com)

大多数关于多级反应的研究，循环的次数通常在三次左右[55-57]。Yaghobi[57]对于多级脱乙酰反应的动力学进行研究，分别单独进行了三次脱乙酰反应，三次的时间分别为1.5h、1.5h和2h。脱乙酰随着循环次数的上升都有小幅提升，在NaOH浓度为45%，反应温度为90℃时，三次脱乙酰反应的脱乙酰度结果为56.7%、63.4%和78.6%。反应时间和碱液的浓度对于多级脱乙酰反应的速率以及产物的脱乙酰度有显著的影响，而温度对于多级反应的影响很小，但是每一级反应依然满足单步反应拟一级动力学关系。多级反应能够提高脱乙酰度的最主要原因是多级处理会提高甲壳素的溶胀程度，其形貌示意图如图3-6所示。Lamarque等[55，56]也进行多级脱乙酰反应的研究，也是进行了三级的脱乙酰步骤，采用三次循环脱乙酰，在100～110℃、NaOH为50%时反应20～30min就可以得到Mw为318000，脱乙酰度78.52%的壳聚糖，同样的条件下只采用一步反应10h后的脱乙酰度只能达到74.4%，Mw为163000（原料甲壳素Mw为1340000）。但在多次反应后，主链会发生不可避免的降解，但是一定程度上降解有利于在晶区内部残余的乙酰氨基实现脱乙酰化。

图3-6　用甲壳素的结构示意图

（2）微波加热和超声波辐射。对于非均相体系脱乙酰反应，扩散是反应速率的主要控制因素，因此，提高亲核试剂在液相中的扩散程度有助于提升脱乙酰反应的效率，比较普遍采用的方法有微波加热和超声波辐射。

微波处理增加分子的运动，从作用效果来看类似于升高温度，所以其对于反应体系的影响基本与温度是相同的。脱乙酰度随着微波处理时间的增加而增加，3～5min会有明显的脱乙酰度提升，一般微波处理时间在20min左右能达到平衡[58-61]；微波的功率越大，脱乙酰度越高，但是分子链的降解程度也会急剧提高[59，60]（图3-7）。

图3-7　微波功率对乙酰度和相对分子质量的影响

甲壳素分子内有比较强的氢键作用，因此，可以利用超声波辐射来比较氢键对脱乙酰反应速率的影响[62]，但是超声波也极易容易使聚合物分子链断裂[63]。

（3）添加相转移催化剂。非均相体系脱乙酰的过程中，存在固相的甲壳素与液相的碱液，通过相转移催化剂使两相之间的接触更加容易。对于其作用机理，通常认为是磷酸盐或者季胺盐与氢氧化钠形成亲脂性的阳离子，这些离子能够进入低极性有机相中，从而促进脱乙酰反应[64，65]。

丁纯梅[66]采用二甲亚砜—氢氧化钠为反应体系，以水作为相转移催化剂制备了完全脱乙酰的壳聚糖，其中催化剂用量控制在1.5mL为宜，催化剂含量过高会导致亲核试剂的溶剂化失活。Sarhan[65]采用浓度25%～50%NaOH，加入少量的相转移催化剂，包括苯基膦烷（BTPP）、苄基三乙基氯化铵（TEBA）、溴化十六烷基三甲基铵（CTMA）、N-苄基-4-氯化二甲基吡啶。这些催化剂中，BTPP对反应的催化效果最好。在50%NaOH、50℃反应温度下，加入相转移催化剂的体系反应6h脱乙酰度可以达到75%，Mw可以达到560000，相比较于没有催化剂体系的反应24h脱乙酰度也只能达到60%，相对分子质量大幅下降，只有350000（甲壳素Mw为7290000）。

（4）冻融法。碳水化合物冷冻加工的已有研究表明，在冷冻的过程中，由于冰晶体的存在以及冰晶的生长和重结晶效应，可能使部分高聚物如纤维素等更易溶解。对于甲壳素碱液先进行循环反复的骤冷—解冻操作，然后进行脱乙酰反应，这样的方法被称为冻融法。

Lamarque[67]最早提出了这种方法，具体的方式是在室温下将甲壳素加入50%的NaOH中，然后反应器真空环境下在液氮中冷却至完全变成固体，再回到室温，重复6～7次上述步骤，然后加热进行脱乙酰反应。与传统方法相比，其对于分子链的破坏作用比较小，能够在保证高乙酰度的前提下最低限度地减少降解反应的发生。在100℃、50%NaOH条件下，经过上述冷冻循环操作后，循环三次的20min的脱乙酰反应就能得到脱乙酰度为97.3%、Mw为642000的壳聚糖。刘廷国[68，69]对于冻融法的反应条件进行了研究，其冻融温度在-18℃和-35℃，快速冷冻对晶体结构的破坏程度较小，反应体系仍属于非均相体系，而慢速冷冻对晶体结构的破坏程度较大，可使甲壳素在溶液中完全溶解。