甲壳素提取工艺参数的优化方法

（一）碱液法

1.碱液法提取原理

目前，甲壳素主要是由碱液法从虾、蟹壳中提取为主，虾、蟹壳的化学成分如表3-1所示[13]，为了提取高纯度的甲壳素就需要去除虾、蟹壳中的蛋白质、碳酸钙、色素等物质。

表3-1　虾、蟹壳的化学成分

提取原理是采用稀酸去除虾蟹壳中的碳酸钙，用碱来去除其中的蛋白质，用高锰酸钾进行褪色，去除其中以虾红素为主的色素，最后得到产物甲壳素[11]，在提取过程中，主要发生的化学反应如下。

（1）盐酸与虾蟹壳中的碳酸钙反应。

（2）蛋白质遇到碱时，会发生水解反应，肽键断裂、各级结构彻底破坏并完全水解成α-氨基酸的混合物。

（3）氧化脱色剂高锰酸钾会破坏虾、蟹壳中的虾红素。虾红素分子结构中有两个β-紫罗兰酮环，11个共轭双键，酸性高锰酸钾与虾红素双键两端的碳各加上一个氧，共轭双键变为两个碳氧双键，得到的氧化产物含有醛，由于醛有较强的还原性，酸性高锰酸钾可继续将其氧化为羧酸，侧位的甲基会被氧化为甲醛，会进一步被氧化为碳酸，碳酸又分解为二氧化碳和水。

2.碱液法的工艺

碱液法的工艺是通过将虾、蟹壳浸泡在稀酸和稀碱的方式，反复进行脱钙和脱蛋白，由于不同动物甲壳中的矿物含量不同，所用盐酸与氢氧化钠的含量也会有微小的差别，大致采用的是先将虾、蟹壳置于HCl溶液中浸泡进行脱钙，后将所得的固体用蒸馏水洗涤，直到中性后对脱钙样品进行干燥和称重。再用NaOH溶液进行脱蛋白，洗涤后需要反复进行上述步骤，直至去除所有的蛋白质与无机物得到甲壳素，清洗后放入氧化物如高锰酸钾或过氧化氢等，对其进行漂白去除其中的虾红素，加入高浓度的NaOH进行脱乙酰基，清洗晒干后获得壳聚糖。步骤如图3-1所示。

图3-1　碱液法提取甲壳素的工艺流程

甲壳素与蛋白质、碳酸钙和色素等共同存在于生物体内，但为了获得高纯度的甲壳素，必须对其进行定量的去除。许多常用去除蛋白质等物质的方法都会对甲壳素本身带来不利影响，例如降解等。为了尽量避免对于甲壳素的破坏，提高甲壳素质量，就需要优化提取工艺参数。

脱钙通常由各类酸进行反应，包括盐酸、硝酸、硫酸、醋酸等，其中盐酸应用最为广泛。虽然盐酸也可能在脱钙的过程中对甲壳素有损害影响，但无论是工业还是实验室中应用最多的都是脱钙酸。为了减少盐酸对于甲壳素的破坏同时保证脱钙效率，Chang和Tsai在研究中用反应曲面分类研究法测得虾壳脱钙使用HCl的最佳浓度[14]。Aline Percot等人分析了酸碱法脱蛋白质和脱矿物质的动力学过程以及温度对于脱蛋白质过程的影响，发现HCl的浓度在2.5%时能最大程度地减少甲壳素的水解[15]。

脱钙的反应时间同样对于反应效率与减少甲壳素水解有重要作用，Aline Percot研究了在环境温度下甲壳素的脱钙特性，如表3-2所示脱钙反应中，盐酸浓度在2.5%时，脱酰化程度普遍在95%以上，可以认为浓度2.5%的盐酸对甲壳素水解的影响较小，同时在反应时间为13min时，对于甲壳素水解影响最小，能最大程度保证甲壳素的完整性。

表3-2　脱钙反应时间对于黏度和脱酰化程度的影响

研究发现，通过碱处理脱蛋白被证明不会损害甲壳素结构。以10%NaOH的含量为基本工艺参数，如表3-3所示，脱蛋白反应在180min时脱酰化程度最低，甲壳素完整性最好。

表3-3　脱蛋白反应时间对于黏度和脱酰化程度的影响

在10%NaOH中脱蛋白24h后，温度改变对于黏度和脱酰化程度的影响，如表3-4所示，温度为70℃时，效果最优。

表3-4　脱蛋白反应温度对于黏度和脱酰化程度的影响

最优提取的方法是：用0.25mol/L的HCl溶液处理15min，1mol/L的NaOH溶液70℃处理24h，甲壳素中钙的含量低于0.01%，乙酰化度95%。此法不仅减少了酸碱的用量，且得到的甲壳素中的灰分含量很低，相对分子质量也比较大，但是动力学变化不好控制，增加了提取的难度。

3.碱液法提取工艺进展

（1）资源化法提取工艺。20世纪80年代，我国提出了资源化法生产工艺，即虾、蟹壳的资源化处理法[16]，综合有效地利用工艺中的固体废弃物，如蛋白质、色素、碳酸钙等，将其中有用的成分分离出来，变为资源。这种方法可以有效地提高资源利用，获取更高的经济效应，同时能极大地降低对环境所造成的污染。

这项技术的关键点在于：从虾、蟹壳中提取甲壳素和壳聚糖的同时也提取了其中的蛋白质、碳酸钙、虾青素和色素等可用资源；生产厂家最好位于海边，可以通过海水洗涤来减少淡水的用量，同时减少烧碱的消耗；采用稀酸稀碱的循环利用模式，降低生产成本以及废料排放。工艺流程是利用虾壳进行脱钙、脱蛋白、脱乙酰基的三脱工艺，见图3-2。

图3-2　资源化法生产工艺流程

在第一批虾、蟹壳脱钙后，残留的高浓度CaCl2滤液可以通过二氧化碳和碳酸钠的加入，生成碳酸钙沉淀，经过过滤和干燥处理制成可利用的碳酸钙。同时，脱钙时所用的HCl也可以二次使用，直到酸碱度靠近中性再排放沉淀碳酸钙，既节约了成本又能提高收益。在脱乙酰的生产过程中，虽然需要加入高浓度的NaOH，但其本身的反应并没有全部消耗，大量的NaOH会附着在虾壳表面，通过洗涤可以将NaOH剥离下来，用于脱蛋白过程的使用。脱蛋白过程中会生成大量的可利用蛋白质，通过盐酸调解pH可以将蛋白质析出、过滤，分离后洗涤除盐，就可以得到干虾壳重量20%左右的壳蛋白，虾壳中氨基酸的组成见表3-5。

表3-5　虾壳蛋白质氨基酸的组成

（2）有机酸结合提取工艺。很多学者不断尝试改进甲壳素的提取方法，利用有机酸来代替盐酸与碱制备相结合的方法，其中有机酸以柠檬酸、苯甲酸等为主。陈利梅等[17]以南美白对虾下脚料为试验材料，用柠檬酸结合NaOH制备甲壳素，同时得到了纯净的柠檬酸钙和蛋白质粉。Nguyen Van Toan等[18]先用0.016mol/L的苯甲酸对虾壳进行预处理，然后再用0.68mol/L盐酸浸泡脱除矿物质，用0.62mol/L的NaOH溶液脱除蛋白质和脂质，研究发现苯甲酸不仅可以中和虾壳中的碳酸盐，而且可以有效水解角质蛋白，可以减少酸碱的用量。

与原有方法相比，该法能够回收虾蟹中的钙和蛋白质，减少对环境的污染，但得到的甲壳素中灰分含量比较高，而且有机酸价格相对比较高。

（3）蚕蛹和蝇蛆提取工艺。

①从蚕蛹中提取。除了从虾、蟹壳中提取甲壳素之外，许多农副产品中也能提取甲壳素，在养蚕地区，大量的蚕蛹壳堆积成为无用的固体废弃物。但甲壳素在干桑蚕蛹体中含量在3%～5%[19]，通过将蛹体內提取蛹蛋白粉和蛹油后，得到的蛹壳杂物中的甲壳素含量高达36%，相比虾壳与蟹壳的含量还要高。通过分析比较蛹壳与虾、蟹壳中的物质组成成分及比例的不同，得知蛹壳含钙质或灰分远少于虾、蟹壳，而蛹壳含油量和色素高于虾、蟹壳，提出了适合于桑蚕蛹壳滤渣（过35目筛）原料制备壳聚糖的生产工艺[20]。

②从蝇蛆中提取。蝇蛆壳同样可以作为甲壳素的来源，与蚕蛹的化学组成相类似，拥有较高的甲壳素含量以及较低的重金属与色素。提取蛋白后的蝇蛆废渣经清洗、干燥得到干燥的蝇蛆壳。将10g干燥的蝇蛆壳放在烧瓶中加入HCl溶液50mL，室温搅拌反应，过滤水洗至中性；然后加入NaOH溶液50mL，室温搅拌反应，过滤水洗至中性；加入1mol/L的盐酸10mL，在室温浸泡0.5h后加入质量分数为0.5%的NaClO溶液50mL，室温反应3h；过滤水洗至中性，干燥即得甲壳素，收率30%。

工艺流程：

蝇蛆废渣→清洗→干燥→干燥的蝇蛆壳→除无机盐→除蛋白→脱色→甲壳素[21]

王爱勤[22]认为从蝇蛆中提取甲壳素过程中，酸碱浓度和温度对其有影响。当酸处理的条件相同时，脱蛋白时碱的浓度越高，温度越高，所得的产率会比较低，这是因为蝇蛆的皮柔软，在碱液中容易降解。产品的脱色情况会随着温度增高而提升，而产率就会下降，根据表3-6的处理方法[23]，可以看出先1mol/L NaOH 80℃浸3h，再1mol/L HCl室温浸24h，效果最优，是最佳工艺。

表3-6　蝇蛆皮制备不同情况下对制备甲壳素的影响(www.xing528.com)

（二）生物法

1.生物法提取原理

目前甲壳素的提取主要采取的方法是对于虾、蟹壳进行“酸脱钙—碱脱蛋白—碱脱乙酰基”的工艺方法，这种制备方法存在许多不足，提取过程中会消耗大量酸和碱，都有一定的腐蚀性。同时，生产过程中会生成大量废液，给环境带来许多污染。1974年从鲁氏毛霉菌丝中发现了甲壳素脱乙酰酶，对于甲壳素和壳聚糖提取提供了新的研究思路，利用菌丝体发酵所产生的蛋白酶来去除蛋白质，同时发酵过程中微生物所产生的酸能用来去除无机物，直接得到甲壳素和壳聚糖。这种制备方法既避免了酸碱的大量消耗也能减轻环境污染。微生物发酵产生有机酸可以将虾、蟹等加工下脚料中的钙溶解起到脱盐的作用，乳酸菌发酵消耗葡萄糖往往能产生大量乳酸，因而常被用于发酵提取甲壳素的研究对象。

微生物发酵法脱蛋白[24]，主要是通过环境友好的真菌或细菌的发酵体系中产生的“酵素”将蛋白质水解从而达到去除的目的。1991年Butler[25]证明通过酶脱乙酰的作用，在真菌和某些细菌中可形成壳聚糖。壳聚糖在真菌细胞中形成是两种酶相互作用的结果，一个是甲壳素合成酶，另一个是甲壳素脱乙酰酶。

首先，利用甲壳素合成酶促进甲壳素前体尿苷二磷酸与N-乙酰葡萄糖胺来合成甲壳素，如方程式（1）中，经过甲壳素的生物合成，单体N-乙酰葡萄糖胺与尿苷二磷酸通过甲壳素合成酶偶联发生催化反应。第二步，甲壳素脱乙酰酶水解甲壳素，形成壳聚糖，如方程式（2）所示。

2.生物法提取工艺

（1）酶法结合化学法提取工艺。段元斐等[26]探索了用复合酶和有机酸将蛋白质和碳酸钙分解转化成可二次高附加值利用的营养成分的方法，在提取甲壳素的同时，有效地将废水转化利用，制得了氨基酸类调味品和柠檬酸钙，基本达到了无污染生产，提高了废弃虾壳、蟹壳的综合利用率，提高了经济效益，工艺流程如图3-3所示。

图3-3　复合酶结合有机酸提取甲壳素流程图

许庆陵[27]用Alcalase酶和柠檬酸分别脱除虾壳中的蛋白质和钙以提取甲壳素，并用超声波结合碱法脱乙酰基制备壳聚糖，结果表明，Alcalase酶脱虾壳蛋白质最佳工艺条件为料液比为1∶10，pH8.0，温度60℃，酶量800U/g，时间5h，蛋白脱出率为32.87%；柠檬酸脱钙效果整体优于盐酸，甲壳素脱钙后的灰分含量为0.87%，符合食品级要求；超声波预处理可以显著提高壳聚糖的脱乙酰度，经超声波预处理后的甲壳素再经碱液处理，脱乙酰度可高达90%以上，超声波预处理的最佳工艺条件为超声功率600W，时间40min。

（2）虾、蟹壳提取工艺。很多科学家运用发酵法并加入酸直接从虾、蟹壳中提取甲壳素和壳聚糖。Jung等[28]分别采用副干酪乳杆菌和粘质沙雷氏菌通过发酵法直接蟹壳中提取甲壳素。首先把新鲜的蟹壳放入50ml的10%浓度的葡萄糖溶液中，利用副干酪乳杆菌在恒温培养振荡器中发酵5天保持30°C，完成后样品用蒸馏水过滤清洗。再次将样品放入50ml的10%浓度的葡萄糖溶液中，并添加粘质沙雷氏菌进行二次发酵，时间变为7天，其他条件与第一次发酵相同。发酵方式去除了无机物和蛋白质，脱盐水平和脱蛋白水平分别为94.3%和68.9%。

（3）黑曲霉提取工艺。黑曲霉是目前常用发酵的真菌，是含甲壳素最多的真菌之一。何灏彦[29]采用酸碱交替法从中提取甲壳素，然后将甲壳素脱乙酰转化为壳聚糖。通过单因素试验和正交试验分析了反应时间、碱液浓度、温度等对壳聚糖脱乙酰度和产率的影响，得出了制备高脱乙酰度壳聚糖的最优条件为：NaOH浓度40%，反应温度110℃，反应时间6h，但产率较低。

另外，黑曲霉除了发酵法提取甲壳素和壳聚糖之外，还能通过电解法提取。黑曲霉细胞壁中主要含几丁质和蛋白质，蛋白质具有可电离的基团，在溶液中能形成带电荷的阳离子和阴离子，在电场中会向一方迁移，从而把蛋白质分离开，这就是电解法制备几丁质的原理。用浓碱在高温下直接使黑曲霉菌丝体中的几丁质脱乙酰基，脱乙酰反应中，反应液中的乙酸根离子浓度逐渐增加，使反应进行1h后速度开始减慢，可以获得高脱乙酰度的壳聚糖产品。贺淹才[30]采用电解法从培养的黑曲霉湿菌体制备甲壳素；采用碱提取法从培养的黑曲霉湿菌体制备壳聚糖。甲壳素的得率为20.6%。所制备的壳聚糖的游离胺基含量为93.76%，0.5%壳聚糖在0.5%醋酸中的运动黏度为5.448×10-6m2/s，黏均分子量为8.275×104，含水量为9.16%，产品得率为12.11%。这种电解法得到的产率相比于发酵法提取壳聚糖产率要高，有一定的经济价值。

（4）米根霉提取工艺。米根霉是生产绿色生物化学品L（+）-乳酸的理想菌种，其细胞壁含有天然的壳聚糖，可以通过米根霉的发酵来直接得到壳聚糖。这个方法步骤简单，对环境的污染也较少。陈世年[31]选用米根霉作为菌种，在32℃、220r/min的条件下摇瓶培养72h，最终得壳聚糖产率为10.1%（占生物量干重），脱乙酰度为92%；并提出在实验过程中应注意培养时间、生物素水平和亚胺环己酮等因素对壳聚糖产量的影响。

（5）丝状真菌提取工艺。以毛霉丝状真菌发酵时形成的菌丝体为原料，利用细胞中存在的甲壳素合成酶和甲壳素脱乙酰酶的自身催化作用，把细胞内合成的甲壳素转变成壳聚糖，可以直接从其菌丝体提取壳聚糖。

①雅致放射毛霉。陈忻等[32]人采用经过筛选的第三代雅致放射毛霉（Accimonueor elegams）在无菌操作台上接种，并放入恒温摇床内培养。结果发现在反应温度28℃、摇床转速250r/min、pH7.4～7.6、培养时间45h的条件下，壳聚糖产率为15.68%，产品结构经IR和XRD确认，脱乙酰度可达85%～90%。

②鲁氏毛霉。王云阳等[33]人对用发酵法从鲁氏毛霉中制备、分离、提取甲壳素和壳聚糖的方法和工艺条件进行了系统研究。结果表明，从菌丝体中提取甲壳素和壳聚糖的工艺条件为：碱处理时NaOH30g/L，温度115℃，时间60min；酸处理时HCl30g/L，温度80℃，时间180min。此外，实验结果也表明，采用较优发酵提取条件后，甲壳素产量可达1.328g/L，壳聚糖产量达0.672g/L，壳聚糖占菌粉干重的7.4%。

3.生物法前景

随着生物技术的发展，真菌类和酶类等被应用于甲壳素和壳聚糖的提取，木瓜蛋白酶、黑曲霉、乳杆菌等大量种类的商业酶都进行了脱蛋白的研究。生物提取壳聚糖和甲壳素相比于酸碱法有很多优势。甲壳类与真菌提取甲壳素对比见表3-7[34]。

表3-7　甲壳类与真菌提取甲壳素对比

目前，对于发酵生物法对原料进行脱钙、脱蛋白的研究越来越多，但对于工业生产依然没有明确的定论。由于种类不同，生产酸和酶的能力、培养环境、脱钙脱蛋白的效力相差甚远。虽然可以通过优化工艺参数、优化选料和方法得到高纯度的甲壳素和壳聚糖，但都难以符合工业生产的需要。最主要的原因就是酶和有机酸生产不足，原料无法充分脱钙和脱蛋白，所以生物发酵法距离用于工业生产还有很长的一段路。