垂直电泳的提取步骤的介绍

所需试剂：6%PAGE：尿素210克，10×TBE 25毫升，丙烯酰胺28.5克，亚甲双丙烯酰胺1.5克，加水定容至500毫升。

提取步骤：

（1）制胶

组装电泳玻璃板，套进封套内，两边用夹子固定。

①封孔：使用吸管将0.5%的琼脂糖胶缓缓注入封套与玻璃板缝隙，使之缓慢流入面板与背板下部缝隙（a. 琼脂糖胶温度以可手持为宜；b. 注意注入胶的连贯性，避免气泡产生）。

配制丙烯酰胺凝胶工作液，配方如下：

四块胶的量

40%丙烯酰胺　40% polyacrylamide　20毫升

10X TBE缓冲液　TBE　buffersolution　10毫升

ddH2O　70毫升

Aps（10%）过硫酸铵（Ammonium persulfate ）　1.2毫升

TEMED　0.1毫升

注意：按试剂顺序依次从上往下添加，加完TEMED最好搅拌均匀。(www.xing528.com)

②注胶：将配制好的丙烯酰胺凝胶工作液缓慢注入面板与背板上部缝隙（可左手持玻璃板套装，右手持胶杯灌入）。注意灌胶连贯性，不可产生气泡。

③插梳子：注胶完毕后，将胶梳子轻轻插入背板与面板缝隙的胶中，3～5毫米即可，不需要完全插进去，注意梳子水平插入，不可倾斜。

（2）点样

①组装电泳槽：待胶完全凝固后（需30分钟，如当日不用可4℃保存过夜次日再用），将套装装入电泳槽中，轻轻拔出胶梳，注意整体水平，缓缓拔出，旋紧电泳槽所有螺母，内外侧均加入适量的1×TBE缓冲液，内侧缓冲液需要没过进胶口。（若胶孔内有气泡请用200微升或1毫升枪吹出气泡）

②点样：2～3微升PCR产物（10微升PCR产物需要提前加入2微升loading buffer）点入胶梳形成的点样孔内， 一个样品对应一个点样孔，切勿串孔。

（3）电泳

设置固定功率15～20瓦（1块胶，2块胶则30～40瓦），电泳1～1.5小时。

（4）显影

①10%乙醇（alcohol）20毫升+0.5%乙酸（acetic acid），加水至200毫升进行固定，固定5分钟。

②0.2%AgNO3（silver nitrate）60毫升，加水至200毫升，银染8～10分钟。

③纯水漂洗1遍 ，纯水漂洗第二遍时200毫升水加入0.04毫升1% Na2S2O3，持续1分钟。

④1.5%NaOH 80毫升加水至200毫升+甲醛（methanal）1毫升进行显影，条带清晰终止反应，清水冲洗胶片，装9号自封袋备用。